台兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化

[目的]建立台兰稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,并对影响台兰ISSR-PCR反应体系的主要成分进行筛选和优化。[结果]台兰的ISSR-PCR优化反应体系为:25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,100 ng模板DNA,0.5 mmol/L dNTPs,0.22 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物,15.78μl双蒸水。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,30 s,72℃延伸50 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]台兰ISSR-PCR优化反应体系为今后利用ISSR技术进行台兰种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件的优化

[目的]优化马齿苋ISSR-PCR反应体系与反应条件。[方法]以马齿苋为试验材料,采用改良的CTAB法提取总DNA,对ISSRPCR引物进行筛选,同时进行ISSR-PCR反应体系和反应条件的优化,电泳检测ISSR-PCR产物。[结果]8个ISSR引物适合马齿苋的ISSR-PCR分析;最适反应体系为总体系25.0μL,其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5μL,10μmol/L引物2.0μL,40 mg/L DNA模板1.0μL,dd H_2O 9.5μL;最适反应条件为94℃预变性360 s;94℃变性60 s,54℃退火60 s,72℃延伸90 s,30次循环;72℃再延伸300 s。[结论]建立了马齿苋ISSR-PCR扩增的最佳反应体系和扩增程序,为进一步研究马齿苋提供基础资料。     

龙牙百合DNA的提取及ISSR-PCR体系的建立

[目的]研究龙牙百合总DNA的提取方法,建立优化的ISSR-PCR反应体系和程序,为种质资源研究奠定基础。[方法]利用改良的CTAB法提取龙牙百合基因组DNA,并对影响ISSR扩增反应的各因素进行优化。[结果]获得了高质量的龙牙百合基因组DNA;优化的龙牙百合ISSR-PCR反应体系为,25μl体系中含60 ng模板DNA,0.4μmol/L ISSR引物,2.0 mmol/L Mg2+,1.5 UTaq酶,0.2 mmol/LdNTPs;反应程序为,94℃预变性5 min;然后进行40个循环:94℃变性50 s,52℃复性45 s,72℃延伸75 s;循环结束后72℃延伸8 min。[结论]建立了适合于龙牙百合的ISSR-PCR反应体系及程序,为种质资源研究奠定了基础。     

蕙兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（英文）

[目的]以蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行筛选和优化,建立适合蕙兰的ISSR-PCR的最佳反应体系。[方法]利用改良的CTAB法提取蕙兰基因组DNA,并对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行优化。[结果]获得了高质量的蕙兰基因组DNA并建立了最适的蕙兰ISSR-PCR体系（25μl）,即2.5μl10×PCRbuffer,2.0mmol/LMgCl2,60ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.85μl;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,复性温度比引物的Tm值低2～3℃,30s,72℃延伸50s,40个循环;72℃延伸7min。[结论]该优化体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行蕙兰遗传多样性研究提供依据。     

龙眼ISSR反应体系的建立和优化

对影响龙眼ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合龙眼的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μl,其中模板DNA 25ng,引物0.2μmol/L,dNTP 100μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,MgCl2 2.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl;扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,退火温度1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸7min。     

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（摘要）（英文）

[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium（Linn.） Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为：DNA浓度（ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（DNA量/所用叶片量×100%）。对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素（DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 ＋和dNTPs）逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。最佳扩增程序为：94℃预变性5min,然后进行40个循环：94℃变性30 s,50 ～60℃退火（退火温度随引物不同而定） 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

萱草ISSR-PCR最佳反应体系的建立

[目的]为利用ISSR标记研究萱草的遗传多样性和和辅助育种奠定基础。[方法]从萱草中提取基因组DNA,建立萱草的ISSR-PCR反应体系,并通过正交试验对其进行优化。[结果]萱草的最佳ISSR-PCR反应体系为:ddH2O16.8μl、2.5 mmol/LdNTP2.0μl、10×buffer 2.5μl、10μmol/LPrimer0.3μl、50 ng/LDNA3μl、Taq酶1 U,总体积25μl。萱草的最佳ISSR扩增反应程序为:94℃变性5 min,94℃变性45 s、48.3℃退火1 min、72℃延伸2 min,共38个循环,最后72℃延伸7 min。该反应程序下进行的ISSR扩增,扩增产物最多,银染的效果最好。[结论]该研究建立了萱草ISSR-PCR的最佳反应体系和反应程序,通过ISSR扩增可获得清晰、稳定的条带。     

春兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化

[目的]为进一步从分子水平上研究春兰种群的遗传多样性奠定基础。[方法]以春兰基因组DNA为模板,通过单因子试验研究ISSR反应体系中主要成分对扩增结果的影响,以寻找适合春兰ISSR分析的反应体系。[结果]春兰的ISSR反应体系较适宜的扩增条件为:25lμPCR反应体积中,15.78μl双蒸水,2.5μl 1×CR buffer,1.1 UTaqDNA聚合酶,100 ng基因组DNA,2.0 mmol/L MgCl2,150μmol/LdNTPs,2μmol/L引物。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行40个循环;94℃变性45 s,复性温度比各引物的TM值略低1~2℃,45 s,72℃延伸75 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存。[结论]该优化系统的建立为进行春兰鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

寒兰基因组DNA ISSR-PCR反应条件的优化

以改良的CTAB法提取的寒兰（Cymbidium kanran Makino）基因组DNA为模板,通过单因子试验建立最适的寒兰的ISS-PCR反应体系。结果表明,适宜寒兰ISSR-PCR反应体系的扩增条件为：25 μl PCR 反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,300 ng 模板 DNA,200 μmol/L dNTP,1.40 U Taq DNA 聚合酶,0.4 μmol/L 引物。最佳扩增程序为：94 ℃预变性 5 min,然后进行40个循环：94 ℃ 变性 30 s,复性温度根据各引物的Tm值略低1～2 ℃,30 s,72 ℃ 延伸 50 s,循环结束后 72 ℃ 延伸7 min。     

均匀设计优化喜盐鸢尾ISSR-PCR体系

以新疆野生喜盐鸢尾DNA为模板, 采用U20(54)和U12(34)均匀设计表,通过4因素5水平和4因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素如Mg2+ 、dNT P、引物以及TaqDNA聚合酶浓度以及循环数和退火温度等进行优化筛选, 建立了适合喜盐鸢尾的最佳ISSR-PCR反应体系:在25 μL反应体系中,包括2.5 μL 10×PCRBuffer ,2.0mmol/L M g2+,250 μmol/L dNTP,0.1 μmol/L 引物,0.5U TaqDNA 聚合酶,40 ng模板DNA.扩增程序为 :94℃预变性3 min;接着进行40个循环:94℃变性45 s,52.1℃退火30 s,72℃延伸1.5 m in;循环结束后,72℃延伸5 min,4℃保存.     

胡萝卜ISSR反应体系优化的研究

以改良CTAB法提取胡萝卜基因组DNA作为ISSR-PCR模板,通过单因素试验建立了一套适合胡萝卜ISSR-PCR的优化的反应体系,即25μL反应液中含10×buffer2.5μL,2.0mmol.L-1Mg2＋,200μmol·L-1dNTPs,Taq酶1.5U,引物0.5μmol·L-1,DNA模板20ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4min,94℃变性40s,48～58℃退火45s,72℃延伸2min,进行35个循环,72℃延伸8min,在16℃保存。应用该优化反应体系筛选出了24条有效引物。     

大果油茶基因组DNA提取及ISSR反应体系建立

【目的】建立大果油茶的ISSR-PCR适宜扩增反应体系和程序,为其深入研究奠定基础。【方法】以大果油茶嫩叶片为供试材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并对其ISSR反应体系条件进行筛选及优化。【结果】提取的基因组DNA纯度和完整性较好,OD260/OD280值在1.8～2.0之间,DNA无降解现象,完全可以满足ISSR-PCR扩增要求。在25.0μLISSR-PCR反应体系中,各组分的适宜浓度配比为：40ng/μL模板DNA1.0μL、2.5mmol/LdNTPs2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL、10μmol/L引物1.0μL、10×PCR Buffer2.5μL（含有Mg2＋）,加ddH2O至25.0μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性40s,52℃和53℃退火40s,72℃延伸90s,40个循环;最后72℃延伸7min。由此可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱。【结论】建立的ISSR-PCR反应体系可用于研究大果油茶遗传变异和多样性。