一种快速简便检测马铃薯病毒的方法——病毒细菌协同凝集法(VBA)的研究

 在国内、外首次选用金黄色葡萄球菌(Staphylococc aureus)的No.180菌株用于病毒细菌协同凝集试验(Virobacterial agglutination test简称VBA)检测了来自马铃薯的4种不同形态粒子的病毒:马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯丫病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯卷叶病毒(PLRV),其灵敏度达2.7~6.1ng/ml,检出病汁液的最大稀释度达10⁴~10⁵(PLRV1:500),较国内、外采用的Cown I菌株的灵敏度提高5~10倍。与血清学方法相比,VBA在2~3分种内就可获得结果,无假阳性反应,其灵敏度显著高于间接酶联法和免疫电镜,而接近于A蛋白酶联法。经抗血清致敏的菌体在4℃下保存4个月,对VBA检测的灵敏度没有影响。用VBA对采自田间的93个马铃薯病样进行检测,它们大多受2~3种病毒(PVX、PVY及PLRV)的复合侵染;和用间接酶联法及鉴别寄主检测的结果趋向一致。室内和田间试验均表明VBA灵敏度高、特异性强、快速简便和经济,尤其适合在基层单位中推广应用。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测

 基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍。结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2~3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染)。     

改进的直接组织斑免疫测定法在植物病毒及细菌检测中的应用

 以改进的直接组织斑免疫测定(IDDTB)的直接法,用碱性磷酸酯酶(Ap)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(IgG)检测病组织中的马铃薯X病毒(PVX)、菁花叶病毒(TuMV)和马铃薯青枯细菌均获得了满意的结果。该法明显地比酶联免疫吸附测定(ELISA)和圆点免疫结合测定(DIBA)的试验程序简单、快速和准确可靠,整个检测程序可在1.5~2小时内完成。据推算其检测PVX的灵敏度相当于0.625ng/ml,可检测病叶的最低稀释度相当于1:320。以IDDTB的间接法用Ap标记的羊抗兔IgG或HRP标记的鼠抗免IgG以及兔抗病毒和细菌的多克隆抗体(IgG)检测病组织中的烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯环腐细菌,除耗时比上述直接法稍长外(约3小时),同样获得较满意的结果。两法均适于在田间应用。IDDTB直接法和间接法检测结果的可靠性均由免疫电镜法得到证实。上述免疫反应的结果因底物不同呈现不褪色的蓝色或深紫色,极易同健康叶片呈现的绿色相区别,并可在室温条件下长期保存。     

基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染广东省冬种马铃薯的病毒

为明确侵染广东省冬种马铃薯的病毒种类及优势病毒,结合小RNA深度测序技术及RTPCR检测方法,对采集于广东省冬种马铃薯7个主产区的189份疑似病样进行检测分析。结果表明,经小RNA深度测序技术检测马铃薯病毒病混合样,发现存在马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)和马铃薯卷叶病毒(Potato leaf-roll virus,PLRV)3种病毒。进一步设计3种病毒的特异性引物并利用国内已报道的其它5种马铃薯病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,发现189份马铃薯病毒病疑似病样中仅检测到PVY、PVS和PLRV这3种病毒,检出率依次为75.13%、10.05%和4.76%,且3种病毒在马铃薯上还存在复合侵染,复合侵染率为14.19%,其中PVY在各马铃薯产区均可检测到。表明侵染广东省冬种马铃薯的病毒为PVY、PVS和PLRV,其中PVY是优势病毒。     

湖南省马铃薯病毒病发生情况调查

为了解湖南省马铃薯种薯质量和主要病毒病发生情况,2019年-2020年马铃薯秋作和冬作期间,对长沙、益阳、湘潭、澧临等马铃薯生产区的155个马铃薯样品,运用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附检测(DAS-ELISA)技术,筛查6种主要马铃薯病毒,包括马铃薯X病毒Potato virus X(PVX)、马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)、马铃薯M病毒Potato virus M(PVM)、马铃薯S病毒Potato virus S(PVS)、马铃薯A病毒Potato virus A(PVA)、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus(PLRV)。检测结果表明:6种马铃薯病毒病在湖南均有不同程度的发生,单一和两种病毒复合感染植株占比最高,其次是3种病毒复合感染,存在极少数植株复合感染4～5种病毒病情况。在秋作马铃薯中,PVY检出率达到29.41%;PVS和PVA检出率均为27.94%;PVM、PVX、PLRV的检出率分别为20.59%、19.12%、17.65%。在冬作马铃薯中,PVX检出率最高,达到31.03%;其次是PLRV,...     

二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法

本研究采用传统的蛋白酶K法和病毒RNA简易浸提法,从马铃薯块茎、茎干、叶梗、叶片中提取马铃薯X病毒,马铃薯Y病毒,马铃薯A病毒及马铃薯卷叶病毒RNA,并设计了4种马铃薯病毒引物,优化了二重RT-PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,扩增产生的靶带分别为562bp(PVX)、480bp(PVY)、336bp(PLRV)、255bp(PVA).应用病毒RNA简易制样技术和优化的二重RT-PCR反应条件,可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此研究还可适合于检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用.     

多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法，可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因，包括马铃薯Y病毒(potato virus Y, PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M, PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S, PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A, PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus, PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid, PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段，产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测，其检测灵敏度在1.6×10^-3～1.8×10^-1 ...     

甘肃省马铃薯主要病毒病发生情况调查

2015年-2016年,在甘肃省10个地市24个马铃薯主栽县(区)146个生态区域(乡镇)采集了757份具有典型症状的马铃薯样品,应用DAS-ELISA法进行检测,筛查6种主要病毒(PVX、PVY、PLRV、PVA、PVS和PVM)。结果表明:631份样品检测到病毒,PVS的检出率最高,达47.03%,PVY次之,为33.82%,PVA最低,只有0.63%;发生复合侵染的病毒主要为PVY+PVS,复合侵染率达到10.13%,三种病毒复合侵染主要是PVY+PVS+PVM;病毒种类和感病程度与品种、地域有关。     

2005年玉林市冬种马铃薯病毒病调查

我区马铃薯种植近年来实现了跨越式的发展,2005年全区冬种马铃薯种植面积达10.2万hm2。2006年春,对兴业县、容县和玉林市福绵管理区的冬种马铃薯进行了病害调查,发现普遍存在疑似病毒症状的病株,病株率从5%到70%不等。用病毒特异的RT-PCR方法检测了田间采集的31个各类疑似病毒病样本,其中30个样本检出病毒,分别是马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯S病毒(PVS),马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯X病毒(PVX)。复合感染现象普遍,其中PVY和PLRV)复合感染最多,有3个样本同时受3种病毒感染。     

马铃薯主产区病毒病发生情况调查分析

在我国马铃薯主产区黑龙江、内蒙古、甘肃、贵州采集了752份具有典型病毒病症状的样品和疑似样品,应用DAS ELISA方法进行检测。主要筛查6种病毒：PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA。结果显示: 270份样品检测到病毒,总体上,PVY的检出率最高,PVS次之,33份样品是由多种病毒混合侵染造成的,田间PVY+PLRV混合侵染率最高,PVS+PVY次之。试管苗PVS病毒发生较多,原原种和大田种薯PVY病毒发生比例最高。     

福建省福清地区马铃薯病毒病病原的分子检测

2017年调查福建福清地区马铃薯病毒病的发生情况,以明确该地区马铃薯主要病毒病原。共采集了46份疑似感染病毒的马铃薯植株,提取总RNA,利用RT-PCR技术进行分子检测,结果表明,福清地区危害马铃薯的病毒有马铃薯Y病毒Potato virus Y(PVY)、马铃薯卷叶病毒Potato leaf roll virus(PLRV)、马铃薯S病毒Potato virus S(PVS),检出率分别为56.52%、17.39%和10.87%,以PVY检出率最高,说明PVY是危害该地区马铃薯样品的主要病毒病原。通过病毒复合侵染进行分析,发现该地区存在病毒复合侵染马铃薯现象。研究结果可为福清地区马铃薯种薯的引进和病毒病害防治提供参考依据。