赤点石斑鱼FAS基因的克隆及序列分析

[目的]研究赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)FAS基因的结构与表达特性。[方法]以前期获得的转录组序列作为数据库,应用PCR技术,获得赤点石斑鱼FAS基因的c DNA全序列。[结果]该序列与大黄鱼(Larimichthy scrocea)FAS基因的相似度最高,为87%。该序列全长8 505 bp,包括712 bp的3'UTR区、7 548 bp的开放阅读框(ORF)以及245 bp的5'UTR区,可编码2 515个氨基酸。经预测,该蛋白分子量为274.03 ku,等电点为5.98,其属于亲水性蛋白。通过Real-time PCR方法获得FAS在赤点石斑鱼各个组织中的表达,结果显示,其在心脏中表达量最高,其次是在肝脏中。FAS基因的进化与物种进化一致。[结论]该研究为进一步研究赤点石斑鱼脂肪代谢奠定理论基础,也为赤点石斑鱼在养殖方面的工作提供基础资料。     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

异育银鲫中科3号MSTN基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of c DNA ends,RACE)方法分离克隆了异育银鲫(Allogyogenetics crucian carp)中科3号肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全长DNA,得到3 394 bp全长的DNA,包含3段外显子和2段内含子,其中2 098 bp的全长c DNA在NCBI数据库中进行序列比对后,确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示:MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73.5%~98.0%,与鲤鱼MSTN基因相似度最高(98.0%),不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT-PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明,MSTN基因在脑中含量最高,其次是肌、鳃、心、肠,在肝脏中含量最低。     

不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析

[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因Bc PR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到Bc PR5基因的全长c DNA序列。采用RT-q PCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(Me J)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]Bc PR5基因的c DNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜Bc PR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-q PCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、Me J和ABA)诱导过程中,Bc PR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]Bc PR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。     

虎杖MYB转录因子PcMYB2基因的克隆与原核表达

为了探究MYB(髓细胞组织增生病毒癌基因同源物)转录因子在虎杖苯丙烷代谢途径中的作用,以虎杖叶片为材料,通过c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得1个MYB转录因子,命名为Pc MYB2,Gen Bank登录号为MG020557。序列分析表明,Pc MYB2基因的c DNA序列全长为938 bp,开放阅读框(ORF)为738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子质量为27. 917 ku。Pc MYB2编码的氨基酸序列具有R2R3-MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3这2个MYB结构域,并且R3结构域中包含1个能与b HLH转录因子相互作用的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序。进化树分析表明,Pc MYB2蛋白与苜蓿中参与原花青素调控的MtPAR聚为1组。将该基因的ORF片段连接到原核表达载体p ET20b中,构建融合表达载体p ET20b-Pc MYB2,转化到大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测显示表达蛋白与预期大小一致,表明成功克隆Pc MYB2基因的c DNA全长序列,构建的原核表达载体p ET20b-Pc MYB2可用于该基因的功能研究。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

东南景天耐镉相关基因SaFer的克隆与功能初步分析

铁蛋白(ferritin)是一种专门存储铁的重要胁迫相关蛋白,参与镉离子吸收的调控。从构建的东南景天Sedum alfredii c DNA文库中筛选出东南景天Ferritin基因c DNA全长,命名为Sa Fer,编码序列为1 117 bp,开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸。以东南景天基因组DNA为模板分离到Sa Fer基因组序列,长度为1 702 bp,含有7个内含子。氨基酸序列同源性分析表明:Sa Fer与苹果Malus domestica Ferritin亲缘关系最近,同源性高达76%。实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)分析发现:根系中Sa Fer基因在镉胁迫12 h后表达显著上调。镉胁迫实验显示,转基因拟南芥Arabidopsis thaliana比野生型有更高的耐镉胁迫能力。Sa Fer基因的分离及其初步功能验证为研究东南景天耐镉机制和林木耐镉转基因育种提供了理论依据。     

富贵竹过氧化物酶全长基因的克隆与表达分析

[目的]克隆富贵竹全长POD基因,检测富贵竹感染斯氏泛菌(Pantoea stewartii)后该基因的表达。[方法]用PCR克隆富贵竹(Dracaena sanderiana)POD部分基因,用hiTAIL-PCR扩增该基因左右两侧序列。通过RT-PCR和qPCR确定POD基因在病原物侵染时的表达。[结果]获得一个长度为3 419 bp的序列,登录号为MZ450796。经基因结构预测,该序列包含1个转录起始位点、加尾信号和4个外显子。进化树分析表明,该基因编码的氨基酸序列与芦笋POD的氨基酸序列一致性最高。接种P.stewartii后,POD基因的表达上调,3 d达最大值。[结论]克隆了富贵竹全长POD基因,确定了POD基因在富贵竹叶片中表达和结构预测的正确性;POD基因被P.stewartii诱导上调表达。     

马氏珠母贝细胞内视黄酸结合蛋白表达及其与类胡萝卜素的相关性分析

[目的]明确细胞内视黄酸结合蛋白(CRABP)对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响,为培育富含类胡萝卜素的马氏珠母贝养殖新品系打下基础.[方法]采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因(PmCRABP)cDNA全长序列,并以实时荧光定量PCR检测分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量.[结果]PmCRABP基因cDNA全长1778 bp,开放阅读框(ORF)长366 bp,编码121个氨基酸,其5'非翻译区(5'UTR)长125 bp,3'UTR长1287 bp.PmCRABP的分子量13.51 kD,理论等电点(pI)5.68,脂溶性系数62.81,不稳定指数35.38,总平均亲水性-0.517,其第5~120个氨基酸为Lipocalin家族的结构域.PmCRABP氨基酸序列与新对虾(Metapenaeus ensis)CRABP氨基酸序列的相似度最高,同属于CRABP蛋白,且二者的空间结构极其相似.PmCRABP基因在马氏珠母贝肝胰腺中的表达量最高,其后依次是外套膜、鳃和闭壳肌,各组织的表达量差异显著(P<0.05,下同).黄白闭壳肌个体的类胡萝卜素含量与PmCRABP基因相对表达量存在显著差异,且二者间呈明显的正相关.[结论]PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢.     

水曲柳CBF1基因的克隆及表达分析

[目的]探讨水曲柳CBF基因的表达及与生物钟调控的关系。[方法]利用c DNA末端快速克隆(RACE)技术克隆水曲柳CBF1基因的全长序列,并对三年生水曲柳幼苗叶片中Fm CBF1基因的时间表达特征进行初步研究。[结果]利用RNA末端快速扩增(RACE)的方法从水曲柳中克隆得到1个CBF基因家族成员Fm CBF1(Gen Bank:KJ541508.1),该基因ORF 669bp,推测编码蛋白质含有222个氨基酸残基,相对分子质量24.5 k D,理论等电点为5.11,在DNA序列内不含内含子。氨基酸序列同源性比较发现,水曲柳Fm CBF1基因与白桦Bp CBF1同源性最高,相似性达79.4%,在系统进化树中处于同一分支上。实时荧光定量PCR表达特性分析显示,Fm CBF1基因的表达具有一个大约以24 h为周期的节律性,最大值约出现在9:00,而夜间却处于较低的表达水平。在4℃低温处理1、3、6、12、24、72和120 h后Fm CBF1的qRT-PCR分析表明,该基因受到低温诱导,并在4℃条件下随低温时间的延长,该基因的诱导表达特性呈先升后降的趋势,最大值出现在12h时,达对照的25.5倍。[结论]为进一步研究水曲柳抗旱耐寒性及分子育种奠定基础。     

黄颡鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1基因的克隆及表达分析

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基因核苷酸序列与鲇形目斑点叉尾鮰的相似度(89%)较高,与鲢、鲤、鲫、草鱼和团头鲂等的差异较大;肝脏是黄颡鱼IGFBP1基因m RNA表达最丰富的组织,IGFBP1基因在雄性个体心脏、肾脏、肌肉和肠组织中的表达量显著高于雌性的(P0.05);IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉组织中都有表达,且在雄性个体中的表达量高于在雌性个体中的表达量。     

弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]研究弗氏链霉菌tylF基因的克隆及其生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR技术、巢式PCR技术和RACE技术从弗氏链霉菌B-62169菌株中克隆获得tyl F基因的全长c DNA序列,并对其生物信息学进行分析。[结果]经Vector NTI 11.0软件拼接获得tyl F基因全长c DNA序列长度为1 245 bp,并带有19 bp长的Poly(A)尾巴,包含927 bp的开放读码框(ORF),编码一个含309个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明,tyl F基因编码的酶是大菌素-O-甲基转移酶,参与分子功能中甲基转移酶活性和生物学途径中甲基化过程。对tyl F基因全长c DNA序列进行蛋白质结构域分析,证实该基因编码Tyl F蛋白,并具有223个氨基酸蛋白结构域。[结论]该研究为阐明泰乐菌素生物合成过程中甲基化反应机理,更进一步研究大环内酯类抗生素生物合成代谢途径提供生物信息学数据支持。     

萼脊兰AGAMOUS(AG)基因的克隆与表达分析

通过对萼脊兰AGAMOUS(AG)基因进行结构、功能分析、克隆和AG基因的表达调控等方面的探究,发现,萼脊兰AG的氨基酸序列属于植物特有的MIKC型MADS-box的C类基因,该基因c DNA全长1 002 bp,包含一个702 bp的开放阅读框,该基因命名为AG(登录号KY744276),共编码233个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AG蛋白与蝴蝶兰蛋白一致性最高,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中α螺旋占48.93%,延伸链占11.59%,不规则卷曲占39.48%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,AG基因在花蕾和蕊柱中表达量很高,说明AG基因的表达具有组织特异性,在ABCDE模型中属于C类基因的特征非常明显,控制着雄蕊和雌蕊的发育。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

[目的]克隆鹅副粘病毒GX1株HN基因与F基因,并进行序列分析。[方法]根据Genbank已发表的鹅副粘病毒GPV-SF02株基因组核苷酸序列设计2对引物,对从广西发病鹅分离到的鹅副粘病毒毒GX1株的HN和F基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。[结果]该株副粘病毒株的HN基因和F基因核苷酸序列全长分别为1 716和1 662 bp,与GPV-SF02株的同源性均在97.3%左右,与LaSota株、F48E9株、JS株的同源性为80.3%~97.5%,与M iyadera株的同源性仅84.8%。[结论]分离株GX1株与禽Ⅰ型副粘病毒(A PMV-1)强毒株特征相符,属于A PMV-1基因Ⅶ型。     

绵羊激活素受体 IIB（ActRIIB）基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析(英文)

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。