注射ACTH对断奶母猪卵泡促黄体素受体表达及卵泡液中类固醇激素合成的影响

[目的]为了探讨应激对断奶母猪繁殖障碍的影响机制,本试验以促肾上腺皮质激素(ACTH)注射所致的应激模型来研究应激对断奶母猪卵泡液中类固醇激素合成及卵泡促黄体素受体表达的影响。[方法]对10头苏淮断奶母猪进行颈静脉插管手术,随机均分为对照组与ACTH处理组(n=5)。手术第3天开始以每次间隔8 h给ACTH处理组母猪注射ACTH(1 IU·kg-1),对照组母猪注射生理盐水,连续注射7 d。利用ELISA方法检测受试母猪卵泡液中类固醇激素及血浆中皮质醇的含量变化;利用荧光定量PCR测定胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、17α-羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)、类固醇激素合成急性期调节蛋白(St AR)、3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、促黄体素受体(LHR)等基因的表达;利用免疫组化法检测CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD蛋白的表达。[结果]人工注射ACTH后40%的受试母猪出现排卵障碍;其血浆中皮质醇的含量极显著升高(P0.01);母猪卵泡液中雌二醇、雄烯二酮含量均显著下降(P0.05);CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD基因表达量降低,其编码的蛋白CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD表达量也明显下降。[结论]ACTH注射所致应激过程中,受试母猪的皮质醇含量升高可导致类固醇合成酶的基因、蛋白表达量明显下降,从而影响类固醇激素的合成及卵泡的发育。类固醇激素合成降低及LHR的低表达影响断奶母猪的正常排卵。     

大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞凋亡的影响

为了探究大蒜素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及H_2O_2引起的颗粒细胞凋亡的影响,采用免疫组化法鉴定凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3在成年母猪卵巢组织中的表达情况,体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,采用放射免疫(RIA)方法检测培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,采用MTT法检测大蒜素对细胞增殖活性的影响,进一步检测卵巢颗粒细胞的凋亡情况。免疫组化结果显示,Cleaved Caspase3在猪卵巢不同发育阶段卵泡的颗粒细胞、膜细胞中有广泛表达,在卵母细胞的胞质中也有分布,在闭锁卵泡中也见明显表达。猪卵巢原代颗粒细胞经大蒜素处理后,细胞培养液中的孕酮含量显著低于H_2O_2处理组,而雌激素水平显著高于H_2O_2处理组,与对照组无明显差异。此外,免疫荧光结果显示,与H_2O_2处理组相比,大蒜素处理组减少了颗粒细胞的凋亡,进一步证实了大蒜素对H_2O_2引起的颗粒细胞凋亡具有缓解作用;进一步应用MTT细胞毒性和增殖试剂盒进行检测,结果显示,与H_2O_2处理组相比,大蒜素处理显著提高了细胞增殖活性。结果表明,大蒜素能够作用于卵巢颗粒细胞,缓解H_2O_2造成的氧化应激,本结果为畜牧生产中进一步应用大蒜素提供参考依据。     

猪卵泡期中等卵泡发育和闭锁的相关基因表达及激素水平分析

研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。     

Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响

为明确Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的作用,采用荧光定量PCR和ELISA方法研究了Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果表明:Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞的孕酮分泌有促进作用,且在一定范围内呈剂量依赖性。100 nmol/L Kisspeptin-10(Kp-10)处理颗粒细胞24 h后,显著增加了孕酮的分泌(P0.05),而10 nmol/L和1 000 nmol/L Kp-10处理组对孕酮的分泌无显著影响(P0.05)。100 nmol/L Kp-10可显著提高孕酮合成的关键基因3β-HSD和St AR的mRNA表达水平(P0.01)。研究结果提示,Kisspeptin可促进牛卵巢颗粒细胞孕酮的分泌,推测这一作用可能通过上调孕酮合成关键基因表达来实现。     

毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究

[目的]本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及机制.[方法]体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞,预培养24 h.用10 nmol·L-1 FSK处理细胞48 h,检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达状况;处理96 h后检测孕酮(P4)水平及类固醇合成相关蛋白的表达水平.[结果]与...     

母猪健康和闭锁卵巢有腔卵泡的转录组测序比较分析

[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。     

GnIH对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素(GnIH)mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH(10-6、10-8、10-10和10-12 mol·L-1)对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素(雌二醇,孕酮)的合成、细胞增殖相关蛋白(cyclin B1,PCNA)表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10-6和10-10 mol·L-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌(P0.01),但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达(P0.01)。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。     

补肾化癖方对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞 CYP450表达的影响

〔摘要〕目的观察补肾化疲方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达的影响〔方法 运用补肾化疲方对PCOS模型大鼠进行干预后,采用免疫组化法观察卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达〔结果模 型组与正常组比较,卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达在表达面积及表达强度上均低于正常组,差异具有统计学 意义(P<0.01);补肾化疲方中、高、低剂量组及妈富降组用药后,卵巢颗粒细胞的CYP450的蛋白表达明显升高,差 异具有统计学意义(P<0.01, P<0.05);其中补肾化疲方中剂量对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达效果 最佳、结论补肾化疲方能增强PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达,调节卵巢内分泌失调,改善PCOS高 雄血症.逆转卵泡的发育异常.使排卵成功、     

褪黑素对HT-2毒素诱导的牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响

[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P0.01)。内质网应激相关基因CHOP和GRP78 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性上调(P0.01),自噬相关基因Atg7 mRNA表达呈浓度依赖性增加(P0.01),p62 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性减少(P0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。     

固醇类物质对鹅颗粒细胞胆固醇转运相关基因表达的影响

【目的】揭示胆固醇转运相关基因在鹅不同发育阶段卵泡中的表达模式及固醇类物质对颗粒细胞上述基因表达的影响。【方法】首先应用RT-qPCR技术检测SREBP-2、STADR4、STAR和CYP11A1在产蛋高峰期鹅卵巢内不同发育阶段卵泡中的mRNA表达水平;然后分离鹅F1卵泡颗粒细胞体外培养,24 h后分别添加不同浓度胆固醇、25-羟胆固醇和洛伐他汀(胆固醇合成限速酶抑制剂)处理,最后使用MTT法检测细胞活性和RT-qPCR技术检测上述基因表达量。【结果】四个基因在不同发育阶段卵泡中的表达模式相似;高浓度胆固醇显著增加细胞活性(P0.05),25-羟胆固醇和洛伐他汀则降低细胞活性。随着胆固醇浓度升高,四个基因表达量均先升高后下降;25-羟胆固醇显著抑制SREBP-2和STAR的表达(P0.05);升高洛伐他汀浓度使SREBP-2表达量先降低后升高,与其余三个基因相反。【结论】胆固醇转运和类固醇激素合成相关基因表达量受固醇种类和浓度调节,并且与卵泡类固醇激素合成密切相关,这为揭示鹅卵泡发育机制和提高产蛋量提供了理论参考。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律研究

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。     

GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞(pGCs)自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】从猪卵巢中提取卵巢颗粒细胞,进行体外培养。1、探究GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间:按孵育GnIH时间梯度(0min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响:按(空白对照、GnIH、p38激活剂(U-46619)、U-46619+GnIH)分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响:按(空白对照、10-6 mol·L-1 GnIH、10-8 mol·L-1 GnIH、10-10 mol·L-1 GnIH、10-12 mol·L-1 GnIH)分组,用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化;4、验证不同浓度GnIH通过p38信号通路对自噬和凋亡的影响:将细胞分成6组(空白对照、U-46619、U-46619+10-6 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-8 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-10 mol·L-1 GnIH、U-46619+10-12 mol·L-1 GnIH),用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化。【结果】1. GnIH孵育10 min后,显著降低p38与p-p38的蛋白表达量(P0.05),提示,GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间为10 min;2. U-46619显著促进pGCs的p38磷酸化水平(P0.05),GnIH显著抑制pGCs的p38磷酸化水平(P0.05),提示,U-46619使p38MAPK信号通路活化,GnIH对p38MAPK信号通路的活化有抑制作用;3.当GnIH的浓度为10-6 mol·L-1时,pGCs的自噬和凋亡水平显著升高(P0.05),随着GnIH浓度的降低,pGCs的自噬水平逐渐升高(P0.05),pGCs的凋亡水平逐渐降低(P0.05),提示,高浓度GnIH可以促进自噬和凋亡,随着GnIH浓度的降低,自噬水平逐渐升高,而凋亡水平逐渐下降;4.加入U-46619后,GnIH使pGCs的自噬显著上调(P0.05),并且使pGCs的凋亡显著下调(P0.05),提示,不同浓度GnIH通过p38MAPK信号通路影响pGCs的自噬和凋亡。【结论】GnIH可能通过抑制p38MAPK信号通路的活化,上调pGCs的自噬,减少pGCs的凋亡。     

WNT6基因对蛋鸡卵泡颗粒细胞的影响及机制研究

[目的]本文旨在研究WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能及其作用机制。[方法]以300日龄海兰蛋鸡为研究对象，检测WNT6 mRNA在不同组织中表达特征。对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，ELISA检测细胞培养基中的孕酮(P4)含量，荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体(FSHR)和StAR、CYP11A1等基因表达水平。设立卵泡刺激素(FSH)浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6及WNT通路相关基因表达水平的影响。[结果]WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖(P<0.01),极显著提高颗粒细胞P4合成量(P<0.01),并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达水平(P<0.05);相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制(P<0.01),P4合成量极显著显著减少(P<0.01),并显著降低FSHR、CYP11A1...     

钙敏感受体及下游PLC/TRPM5介导苯丙氨酸刺激猪十二指肠分泌胆囊收缩素

[目的]本文旨在探究苯丙氨酸(Phe)体外灌流对猪十二指肠组织胆囊收缩素(CCK)分泌的影响,以及钙敏感受体(CaSR)、鲜味受体(T1R1/T1R3)、下游磷脂酶C(PLC)和瞬时受体电位离子通道蛋白5(TRPM5)在该过程中的作用。[方法]以猪十二指肠为研究对象,利用免疫印迹技术检测CaSR在猪十二指肠上的表达;在此基础上,利用组织体外灌流系统探究Phe对猪十二指肠CCK分泌的影响,再通过抑制剂或激活剂揭示CaSR、T1R1/T1R3以及PLC和TRPM5对CCK分泌的作用。[结果]猪十二指肠表达CaSR;50 mmol·L~(-1)L-Phe而非D-Phe能够显著刺激CCK的分泌(P0.05);加入CaSR抑制剂NPS 2143(25μmol·L~(-1))或calhex 231(20μmol·L~(-1))均可显著抑制L-Phe诱导的CCK分泌(P0.05),但加入T1R1/T1R3激活剂肌苷酸(IMP,2.5 mmol·L~(-1))或抑制剂lactisole(5 mmol·L~(-1))后CCK的分泌并无显著变化(P0.05);通路下游PLC抑制剂U-73122(10μmol·L~(-1))和TRPM5抑制剂氧化三苯基磷(TPPO,100μmol·L~(-1))均可显著抑制L-Phe诱导的CCK分泌(P0.05)。[结论]L-Phe通过激活CaSR以及下游PLC/TRPM5刺激猪十二指肠组织分泌CCK。     

生物钟基因对牦牛卵巢类固醇激素合成的影响

【目的】旨在研究生物钟基因对牦牛卵巢类固醇激素合成的影响,为生物钟靶向调控牦牛繁殖力提供理论依据。【方法】以于08:00左右（ZT0）和20:00左右（ZT12）收集的雌性牦牛血液和卵巢组织为材料,研究牦牛血清类固醇激素含量、卵巢中类固醇合成基因（StAR、Cyp11a1、Hsd17b3、Cyp19a1）以及核受体基因（Sf1、Lhcgr、Nr1h4、Nur77）是否存在昼夜节律性变化;分析生物钟基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）、生物钟蛋白BMAL1和类固醇合成蛋白（StAR和CYP19A1）在牦牛卵巢中的时空表达规律;以及生物信息学预测牦牛类固醇合成相关因子启动子区域生物钟作用元件。【结果】牦牛体内雌二醇和孕酮含量存在昼夜节律性变化,ZT0的含量均极显著低于ZT12(P<0.001);类固醇合成基因（Cyp11a1、Hsd17b3和Cyp19a1）、核受体基因（Sf1、Nr1h4和Nur77）和4个生物钟基因在牦牛卵巢中均存在节律性表达;生物钟蛋白BMAL1在牦牛卵巢中存在节律性表达,且主要分布在卵巢颗粒细胞;类固醇合成蛋白CYP19A1在牦牛卵巢中存在节律性表...     

神经介素U在体外对猪淋巴细胞活性及自然杀伤细胞活性的影响

[目的]本文旨在研究神经介素U(NMU)对猪外周血淋巴细胞(PBL)的免疫调节作用。[方法]以小梅山猪为研究对象,用半定量RT-PCR方法研究了猪PBL中NMU及其受体(NMUR1和NMUR~2)基因的表达,用免疫组织化学染色方法检测了猪PBL中NMU及其受体蛋白的分布,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞计数法研究了NMU对猪PBL细胞和NK细胞活性的影响。[结果]NMUR1 mRNA在猪PBL中表达,NMU和NMUR1蛋白在猪PBL的胞膜及胞浆均有分布。用不同浓度(0.01、0.1、1、10、100和1 000 nmol·L~(-1))NMU处理体外培养的PBL,与对照组相比,0.1、1和10 nmol·L~(-1)NMU极显著提高猪PBL的细胞活性(P0.01),且当NMU浓度为10 nmol·L~(-1)时,PBL活性的水平达到峰值(179.4±3.0)%。用不同浓度(0.01、0.1、1、10、100和1 000 nmol·L~(-1))NMU处理体外培养的PBL细胞作为效应细胞,以K562细胞作为靶细胞。与对照组相比,在效靶比为15∶1时,0.1、1和10 nmol·L~(-1)的NMU均能显著提高NK细胞的细胞活性(P0.01);效靶比为30∶1时,1和10 nmol·L~(-1)的NMU均能显著提高NK细胞的细胞活性(P0.01);在效靶比为60∶1时,10 nmol·L~(-1)NMU能显著提高NK细胞的细胞活性(P0.01)。[结论]NMU及NMUR1在猪PBL中均有表达,且NMU在一定浓度范围内能提高猪NK细胞对K562细胞的杀伤能力。     

杜氏盐藻LYCB基因克隆及在盐胁迫下的表达分析

[目的]为探究杜氏盐藻(Dunaliella Salina)富集β-胡萝卜素的分子机理。[方法]本文选用从运城盐湖分离的杜氏盐藻株系Ds-YC011为试材,克隆编码番茄红素-β-环化酶(lycopene b-cyclase,LYCB)的基因(DsLYCB)并分析其功能。[结果]DsLYCB基因cDNA全长1 910bp,开放阅读框(ORF)长1 769bp,编码584个氨基酸。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构,定位于叶绿体。蛋白二级结构中α-螺旋结构占39.9%,杜氏盐藻DsLYCB蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,在高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因表达量显著上升,胁迫4h时表达量达峰值,为正常对照(1.5mol·L~(-1))条件下的2倍。高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因上调表达模式与藻细胞类β-胡萝卜素积累增加相一致,预示着DsLYCB在杜氏盐藻类β-胡萝卜素合成积累中起重要作用。[结论]这为解析微藻类胡萝卜素合成调控机制及遗传修饰提供了科学依据。     

原花青素对体外培养牛卵泡颗粒细胞增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响

【目的】探究原花青素（proanthocyanidins,PC）对体外培养的牛卵泡颗粒细胞（granulosa cells,GCs）增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响。【方法】采集性成熟荷斯坦奶牛卵巢组织,分离卵泡GCs,使用免疫荧光对其进行鉴定。用不同质量浓度（10,30,50,70和90 μg/mL）的PC对牛卵泡GCs作用不同时间（12,24和48 h）后,测定GCs存活率。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测10,50和90 μg/mL PC对牛卵泡GCs周期相关基因（CCND1和CCND2）、凋亡相关基因（caspase-3、caspase-9和Bim）以及类固醇激素合成相关基因（CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD）相对表达量的影响,并检测培养上清液中类固醇激素（雌二醇（E₂）和孕酮（P₄））的浓度。【结果】分离获得了纯度较高的牛卵泡GCs。当PC质量浓度为50 μg/mL且培养24 h时,牛卵泡GCs的存活率最高。当PC质量浓度为50 μg/mL时,牛卵泡GCs周期相关基因CCND1和CCND2相对表达量均极显著升高（P＜0.01）;凋亡相关基因caspase-3和caspase-9相对表达量均极显著降低（P＜0.01）,Bim相对表达量显著降低（P＜0.05）;E₂和P₄浓度均极显著增加（P＜0.01）;类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。当PC质量浓度为10 μg/mL时,牛卵泡GCs凋亡相关基因caspase-3的相对表达量显著降低（P＜0.05）;P₄浓度显著增加（P＜0.05）;CYP19A1和3β-HSD相对表达量均显著升高（P＜0.05）,CYP11A1和STAR相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。当PC质量浓度为90 μg/mL时,E₂浓度显著增加（P＜0.05）,P₄浓度极显著增加(P＜0.01）;CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。【结论】50 μg/mL PC通过促进牛卵泡GCs周期相关基因的表达和抑制凋亡相关基因的表达而促进牛卵泡GCs的增殖。10～90 μg/mL PC通过促进类固醇激素合成相关基因的表达而促进了牛卵泡GCs合成和分泌类固醇激素,进而影响牛卵泡GCs类固醇激素合成与分泌功能。