山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究

为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05);添加50μmol/L H2O2组MDA含量和SOD的活性均与对照组无显著性差异(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P0.05);细胞DNA倍体检测发现添加50μmol/L H2O2时,细胞DI为1.08±0.01,未出现异倍体;其他各组细胞DI分别为1.15±0.02、1.20±0.03、1.26±0.03和1.32±0.01,均有异倍体产生。本研究分离纯化了GSCs,并进行培养和鉴定,200μmol/L H2O2处理GSCs后,SOD活性显著降低,MDA含量显著增加,出现明显的异倍体,200μmol/L H2O2是建立GSC氧化应激模型的适宜浓度,以此为后期建立GSC氧化应激模型提供研究基础。     

犊牛睾丸支持细胞的原代培养与鉴定

寻求简便经济的方法分离纯化犊牛睾丸支持细胞,通过不同的方法对支持细胞进行鉴定。采用胶原酶和胰蛋白酶次第消化分离犊牛睾丸支持细胞,5 h后换液,24 h后用Tris-HCl处理除去精原细胞,实现进一步纯化。用Feulgen染色法鉴定支持细胞,用SABC染色法检测支持细胞上Fas-L的表达。结果培养的支持细胞纯度达到90%以上。Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。SABC染色法检测支持细胞为阳性。建立了培养犊牛睾丸支持细胞的方法,Feulgen染色和Fas-L检测是鉴定支持细胞的有效方法。     

鸭胚睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

为探究鸭胚睾丸支持细胞的分离培养方法,选取２４日胚龄的麻鸭鸭胚４０个,取出睾丸,采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶二步消化分离睾丸细胞,差异贴壁与低渗处理的方法进行纯化,于３７℃,体积分数５％二氧化碳条件下培养,最终得到纯度较高的支持细胞．经染色鉴定,发现罗丹明１２３染色显示支持细胞中富含线粒体;ＡＫＰ检测发现８０％的细胞呈ＡＫＰ阴性;吖啶橙染色显示支持细胞细胞质中富含ＲＮＡ;油红Ｏ染色显示睾丸支持细胞细胞质中含有大量脂肪滴,细胞核内可见双极小体．本试验结果说明采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶结合消化,经差异贴壁与低渗出处理纯化,可得到较高纯度的支持细胞;结合罗丹明１２３染色法、ＡＫＰ染色法、吖啶橙染色法与油红Ｏ染色法可有效鉴定支持细胞．     

和田羊睾丸支持细胞的体外培养与分离鉴定

【目的】研究和田羊睾丸支持细胞的体外培养特性。【方法】取新生和田羊睾丸组织,利用两步酶消化后,采用差速贴壁法纯化细胞进行体外培养,并通过形态学观察、HE染色、AKP染色、油红O染色、吖啶橙染色、罗丹明123染色、免疫组化染色、RTPCR和MTT法检测细胞活性及纯度。【结果】培养基中加入2.00%血清浓度的DMEM/F-12可提高支持细胞纯度,在体外培养传至20代的和田羊睾丸支持细胞形态和核型均为正常;所培养的细胞内波形蛋白表达及标志基因SCF和GDNF的表达均为阳性。【结论】本试验成功建立了和田羊睾丸支持细胞体外培养模型。     

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

[目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(Sertoli cell),用以研究它对精原干细胞(SSCs)生长的影响。[方法]取鼠龄3~7 d的雄性ICR小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和DNA酶消化分离Sertoli细胞及SSCs,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用Sertoli细胞作饲养层观察SSCs的生长情况。[结果]Sertoli细胞纯度达90%,且以Sertoli细胞作饲养层培养SSCs,与对照相比,能明显促进SSCs的增殖。[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的Sertoli细胞,且Sertoli细胞能明显促进SSCs的增殖。     

新生犊牛睾丸支持细胞的高效分离培养与鉴定

【目的】采用改良方法对犊牛睾丸支持细胞进行体外快速分离培养,以期建立一种简单快捷的支持细胞原代培养方法。【方法】采用1.0 g/L的Ⅳ型胶原酶和2.5 g/L的胰蛋白酶,对经分离曲细精管和组织剪碎2种方法处理的睾丸组织进行次第消化,比较2种方法对睾丸支持细胞分离效果的影响;采用福尔根染色法和免疫细胞化学方法鉴定睾丸支持细胞。【结果】睾丸组织采用分离曲细精管后进行酶消化的时间(8 min)较组织剪碎法(15min)短,并且前者消化所得有效细胞数(1.0×107)高于后者(0.81×107),两者具有显著差异(P0.05);福尔根染色和免疫细胞化学染色结果显示,分离细胞有卫星核小体存在,且细胞中ABP阳性表达,表明分离培养的细胞确为睾丸支持细胞。【结论】睾丸组织经曲细精管分离后进行胶原酶和胰蛋白酶次第消化,有助于快速高效分离睾丸支持细胞。     

细胞自噬与疾病的研究进展

细胞自噬(Autophagy)是细胞将受损的细胞器、废弃细胞质和变性或衰老的蛋白质转运至溶酶体(Lysosome),并进行酶解的一个生物学过程。在真核生物中,细胞自噬是一个高度保守的过程,而自噬是细胞的一种自我保护机制,维持了细胞内稳态。自噬在细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)、心血管疾病、肝脏疾病、神经性疾病、癌症与肿瘤以及自身免疫性疾病等多种疾病过程扮演了重要的角色。该文综述了细胞自噬与多种疾病的研究进展,提示了细胞自噬在免疫相关性疾病过程中发挥着重要的调控作用,从而阐明细胞自噬可能作为疾病治疗的新靶点和突破口,为治疗免疫相关性疾病做铺垫。     

真菌细胞自噬的研究进展

为了维持细胞内部物质与能量的动态平衡,真菌在进化过程中形成了一些复杂的机制来调控胞内物质的代谢和循环,其中的一条重要途径就是自噬.自噬在真核生物体内是高度保守的,其通过形成具有双层膜结构的自噬体囊泡,将细胞内受损的细胞器或蛋白质包裹起来,随后运输到液泡中进行降解.在过去20多年里,人们对真菌细胞自噬进行了深入的研究,通...     

新生牛睾丸支持细胞的体外培养及鉴定分析

为探究支持细胞的体外培养特性,以新生牛睾丸组织为试验材料,利用组合酶消化法将其解离成单细胞悬液,并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养与鉴定.结果表明:支持细胞体外培养能够传至第20代,并且随着传代次数的增加,支持细胞的增殖速度越来越慢;添加2％血清浓度的DMEM/F-12的培养基即可用于支持细胞的体外培养;免疫组化染色显示,所培养的细胞内波形蛋白呈阳性;RT-PCR检测结果可见支持细胞标志基因SCF和GDNF的表达;第15代的支持细胞内含有正常的二倍体核型.     

细胞自噬与多囊卵巢综合征研究进展

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是导致女性月经不调、排卵障碍性不孕的主要原因,确切发病机制尚未阐明。自噬可以发生在卵泡发育的各个阶段,卵泡颗粒细胞自噬相对活跃,具有促性腺激素依赖性和细胞特异性。卵泡颗粒细胞自噬稳态平衡以维持卵巢功能,调控卵泡发育,影响胚胎质量和妊娠结局。PCOS卵泡颗粒细胞自噬活性过高,自噬相关基因表达过强,与PCOS卵泡发育异常、内分泌代谢紊乱、临床自然流产率高和辅助生殖中发生卵巢过度刺激综合征风险增高密切相关,可能是PCOS发病的重要机制。补肾中药通过下调PCOS卵泡颗粒细胞过度自噬,改善卵巢功能,维持机体阴阳平衡,但具体作用机制亟待进一步阐明,为PCOS、不孕症等妇科疑难病症临床诊疗提供新思路。     

大鼠睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。     

血管平滑肌细胞自噬的激活与作用

血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁的重要组成部分,是调节血压、向周围组织输送氧和营养物质的基础细胞之一。多种因素通过调节VSMCs自噬影响VSMCs的生存状态,引起VSMCs生物学行为的变化,从而参与血管相关疾病的发生与进展。以调节VSMCs自噬为靶向,可为寻找防治血管相关疾病策略提供新思路。     

细胞自噬与血液肿瘤关系的研究进展

自噬是真核细胞中特有的生命现象,是胞浆大分子物质通过溶酶体途径自我降解的生物学过程,它广泛参与多种生理和病理过程,在促进细胞生存、维持细胞自我稳态方面起重要作用.目前很多研究表明,自噬和血液系统中多种肿瘤的关系密切,因此,通过自噬途径寻找新的肿瘤治疗靶点,是一种治疗肿瘤的新方法.该文主要综述了细胞自噬与血液肿瘤的研究进...     

细胞自噬及其与肿瘤发生关系的研究进展

自噬在肿瘤的发生以及发展中的作用已成为近些年生物医学界研究的热点,自噬对肿瘤的发生和发展起到抑制和促进的双重作用。药物可以通过诱导肿瘤细胞发生自噬使其死亡,但在某些情况下自噬也能起到保护作用,减少化疗药物对细胞的杀灭作用,降低药物疗效甚至导致肿瘤细胞产生耐药性,还能决定某些肿瘤的发展方向,所以通过激活或抑制自噬的手段可达到对肿瘤的治疗效果。调控自噬发挥的作用可能成为治疗肿瘤的新靶点。     

水稻和昆虫细胞自噬期间自噬体发生的细胞学机理

【目的】从细胞学角度研究细胞自噬过程中膜结构细胞器的变化及其与自噬体发生的关系。【方法】以基因互作引起细胞调亡现象发生的水稻爪粳杂种F1和天然化合物印楝素、喜树碱、苦参碱诱导凋亡的昆虫细胞Sf9为材料,通过透射电子显微镜和荧光显微镜技术观察细胞自噬凋亡期间自噬体的特征。【结果】水稻杂种F1花粉母细胞在不同发育时期存在不同程度的退化,部分细胞内线粒体形态发生显著变化,形成长哑铃型或线管状,最后两端弯曲形成双层膜结构的细胞器;绒毡层细胞均出现内质网膨大,且逐渐包裹周围其它细胞器,如线粒体,形成双层膜结构的自噬体,最终引发细胞的自噬性凋亡。喜树碱和苦参碱诱发凋亡的细胞胞内线粒体形态发生拉长、弯曲,最后闭合形成包裹其它细胞器的双层膜结构自噬体;印楝素和喜树碱诱发凋亡的细胞胞内核通过分页和出芽的方式形成双层膜结构自噬体。【结论】动植物细胞自噬凋亡过程中,内质网、线粒体和细胞核3种膜结构细胞器均是自噬体膜结构的直接来源,然而3种膜结构细胞器参与自噬体形成的程度和方式因物种、细胞种类以及自噬诱发因素的变化而不同。     

山羊腺垂体细胞的分离培养与鉴定

【目的】探讨山羊腺垂体细胞的分离和培养方法,为其体外分泌特性研究奠定基础。【方法】采集山羊腺垂体,分别用胰蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶和胶原酶混合、胰蛋白酶和透明质酸酶混合对其进行消化,所获细胞培养后采用免疫细胞化学法进行鉴定,评价细胞消化结果和腺垂体细胞的生长特性。【结果】山羊腺垂体组织在37℃条件下,以1 g/LⅣ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶混合消化2.5～3 h,消化效果较好;所得细胞在培养24 h开始贴壁,72 h后细胞主要呈多角形或梭形,连接成片,培养6 d左右细胞即可铺满培养器皿的细胞生长面。免疫细胞化学鉴定结果显示,FSH阳性细胞胞质呈蓝色,PRL阳性细胞胞质呈蓝褐色;放射免疫分析法测定表明,分离、培养的腺垂体细胞具有激素分泌活性。【结论】采用筛选的消化和分离方法可获得山羊腺垂体细胞,所获腺垂体细胞体外培养体系,可用于体外研究腺垂体细胞的功能和内分泌调控作用。     

细胞自噬机制与植物天然性免疫研究进展

介绍了植物中的细胞自噬系统,并对细胞自噬在植物天然性免疫反应中的作用进行阐述,它通过降解死亡信号分子对病原体诱导的过敏性细胞程序性死亡(HR-PCD)进行负调控,将HR-PCD限制在感染部位。同时阐述了自噬与HR-PCD效应的关系,以及叶绿体自噬对植物免疫作用的最新进展。     

成年兔睾丸支持细胞的分离纯化

简化睾丸支持细胞的分离纯化方法,提高支持细胞的获取量和活率。取5月龄公兔,去除睾丸被膜及血管,分离出完整的曲精细管后用0.5%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化并进行低渗处理,将制成的细胞悬液植入25cm2的培养瓶,于38.7℃5%CO2条件下培养,此期间每天用倒置显微镜进行观察。结果表明,经1/3组低渗处理后,离体支持纯度和活率分别达到72.04%和84.5%(P<0.05),极大地提高了离体支持细胞的获取量和活率。     

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

为进一步简化、优化SD大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法,采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞,并用HE染色、油红染色、Feulgen染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。结果表明：平均0．10g睾丸组织可获得2．5×10^6个支持细胞,细胞存活率90％以上,体外培养5h后开始贴壁,96h后细胞生长速率下降,其对数生长期为3—7d,整个体外生长周期约为10～15d。对获得的纯化细胞进行鉴定,发现其形态结构及超微结构与支持细胞的形态特征一致。可见,采用三酶两步消化法和差异贴壁法,可达到分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞的目的。