ASAP1调节巨噬细胞对结核分枝杆菌吞噬作用的研究

[目的]结核病是全球最重要的人畜共患传染病之一,Arf核糖激化因子GTP酶活化蛋白(ASAP1)与结核病易感性相关。本文旨在明确在细胞水平ASAP1表达与结核分枝杆菌感染的关系,探究ASAP1是否参与巨噬细胞对Mycobacterium tuberculosis(Mtb)的吞噬以及了解该蛋白表达对巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌的影响。[方法]以人源单核细胞建立的不同ASAP1表达水平的巨噬细胞作为模型,通过感染结核分枝杆菌开展了一系列体外试验,使用BCG和Mtb H37Ra菌株感染THP-1分化的巨噬细胞,Western blot以及荧光定量PCR检测感染后ASAP1的表达;建立不同ASAP1表达水平的巨噬细胞,进一步研究ASAP1对巨噬细胞吞噬Mtb H37Ra的调节作用;利用Mtb H37Ra感染不同表达ASAP1的巨噬细胞,通过细菌菌落计数及细胞免疫荧光试验,检测ASAP1表达水平与巨噬细胞吞噬Mtb H37Ra的关系。[结果]Mtb H37Ra感染诱导ASAP1表达上调,BCG感染不能诱导ASAP1表达上调,说明ASAP1参与了巨噬细胞对Mtb H37Ra的吞噬作用;利用Mtb H37Ra感染不同ASAP1表达水平的巨噬细胞,证实ASAP1低水平表达的巨噬细胞对Mtb H37Ra吞噬能力减弱,高水平表达的巨噬细胞对Mtb H37Ra的吞噬能力增强,ASAP1表达水平与巨噬细胞对Mtb H37Ra的吞噬能力呈正相关。[结论]Mtb感染能诱导ASAP1高水平表达,ASAP1参与巨噬细胞对Mtb吞噬,并通过该蛋白表达对巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌进行调控,ASAP1的超高水平表达可诱导巨噬细胞对Mtb过多地吞噬。     

Hedgehog和NF-κB信号通路在结核分枝杆菌感染Ⅱ型肺泡上皮细胞中的免疫调控作用初探

探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcells,AECⅡ)的免疫应答过程中,Hedgehog与NF-κB信号通路及炎症细胞因子的表达变化规律。利用结核分枝杆菌BCG(Bacillus Calmette-Guérin,BCG,卡介苗,弱毒株)和H37Rv(国际标准强毒株)株分别感染人AECⅡ细胞株A549,利用q PCR和Western blot检测Hedgehog信号通路以及NF-κB信号通路相关因子和炎症细胞因子的表达变化。结果表明,H37Rv和BCG感染A549细胞后,Hedgehog信号通路中Shh、Ptch和Gli1与NF-κB信号通路中p-NF-κB m RNA的表达水平升高,同时,伴随着炎症细胞因子IL-8和TNF-αm RNA的表达水平也升高。并且,H37Rv感染A549细胞引起信号分子Shh、Ptch、Gli1和NF-κB蛋白的表达水平高于BCG。Mtb感染AECⅡ细胞都能激活Hedgehog信号通路和NF-κB信号通路并促进细胞的炎症因子分泌,强毒株感染对信号通路的活化强于弱毒株。     

lincRNA Cox2通过miR-129-5p/AMPK调控BCG感染的巨噬细胞糖酵解进程

【目的】探究lincRNA Cox2对BCG(Bacillus Calmette-Guérin)感染的RAW264.7巨噬细胞糖酵解进程的调控作用,阐明Mtb与巨噬细胞之间的相互作用,为结核病的诊断和治疗提供新的靶点。【方法】利用小干扰RNA敲减lincRNA Cox2的表达,以及使用miR-129-5p mimics过表达载体,结合BCG感染,通过实时荧光定量PCR检测lincRNA Cox2、miR-129-5p和促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达量;乳酸含量检测试剂盒检测乳酸（LD）的分泌情况;平板涂布法检测巨噬细胞菌载量情况;双荧光素酶报告基因系统验证lincRNA Cox2与miR-129-5p以及miR-129-5p与AMPK的互作关系;蛋白免疫印迹检测AMPK(AMP依赖蛋白激酶)及糖酵解途径中关键基因HK1（己糖激酶1）、PKM2（丙酮酸激酶2）和LDHA（乳酸脱氢酶）的表达变化。【结果】BCG感染12 h能够极显著上调RAW264.7巨噬细胞中lincRNA Cox2的表达（P=0.000013）,与BCG组相比,siRNA+BCG组中AMPK(P=0.0...     

牛结核分枝杆菌Mce4E蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOs、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

探讨Mce4E蛋白在牛结核分枝杆菌致病机理中的作用。以Mce4E蛋白刺激肺泡巨噬细胞24和48h后,MTT检测分析表明,Mce4E蛋白对巨噬细胞的活性有显著的抑制作用(P<0.05);用重组表达的Mce4E蛋白、人分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.tuberculosis,MtbPPD)、牛结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative of M.bovis,MbPPD)、卡介苗(Bacille Calmette Guerin,BCG)和刀豆蛋白A(con-canavalin A,ConA)分别刺激肺泡巨噬细胞48h后,real-time PCR方法检测显示,Mce4E蛋白能够促使牛肺泡巨噬细胞TNF-α和IL-6 mRNA的表达上调(P<0.05)、抑制肺泡巨噬细胞iNO的mRNA表达(P<0.05)而对IL-12表达没有影响(P>0.05)。Mce4蛋白能够促使肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子,并对肺泡巨噬细胞有抑制作用,证实Mce4蛋白在分枝杆菌中具有重要的作用。     

小鼠IL-1Ra蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

以小鼠脾脏cDNA为模板，用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒，在37℃诱导表达，重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子，制备特异性多克隆抗体；测定多克隆抗体的效价达到1∶4 096 000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体，为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。     

强力天麻杜仲胶囊对小鼠巨噬细胞活性的调节作用

[目的]研究强力天麻杜仲胶囊对小鼠巨噬细胞活性的影响。[方法]将强力天麻杜仲胶囊,连续给小鼠灌胃2周,计数小鼠腹腔巨噬细胞总数。采用ELISA法检测腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-1β分泌水平;通过腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验检测小鼠巨噬细胞的吞噬能力。[结果]结果表明,强力天麻杜仲胶囊能够轻度抑制小鼠腹腔巨噬细胞数量,明显降低腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-1β的分泌水平和抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。[结论]强力天麻杜仲胶囊可降低小鼠巨噬细胞活性。     

小茴香对小鼠免疫功能的影响

[目的]研究小茴香对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响。[方法]以环磷酰胺制备小鼠免疫低下模型并结合体外药理试验,测定灌胃给药后小鼠体内巨噬细胞吞噬率、血清溶血素抗体水平,并观察植物血凝素诱导T淋巴细胞的增殖反应。采用含药血清体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,MTT法考察巨噬细胞的活性,并观察体外培养的巨噬细胞吞噬红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。[结果]小茴香提高免疫抑制小鼠碳粒廓清率,促进血清溶血素形成以及促进T淋巴细胞增殖。[结论]小茴香有提高小鼠免疫功能的作用。     

结核分枝杆菌Rv3519表达与其生物被膜形成能力的研究

采用结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜的形成能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测生物被膜态的不同结核分枝杆菌Rv3519表达水平,分析Rv3519基因表达与结核分枝杆菌生物被膜形成能力的关系。结果表明:临床分离株产膜能力较H37Rv明显偏低,差异显著(P0.01);临床分离株之间生物被膜产量差异不显著(P0.05);生物被膜态的分离株较标准株Rv3519基因表达量偏低,差异显著(P0.01)。说明结核分枝杆菌生物被膜形成能力与Rv3519基因表达水平相关,Rv3519基因可以作为结核分枝杆菌生物被膜形成能力的潜在分子诊断标志。     

结核分枝杆菌RpfE蛋白的原核表达及鉴定

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增复活促进因子E(rpfE)基因,并将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,重组表达质粒pET32a-rpfE转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示目的蛋白在细菌裂解上清和沉淀中均有表达,进一步对可溶表达的蛋白通过镍柱亲和纯化,获得高纯度的重组蛋白。Western-blotting试验结果表明:重组RpfE蛋白能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。这为探索RpfE蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制等奠定基础。     

结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况预测及分析

[目的]对结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况进行预测和分析。[方法]利用NetMHC server生物信息学软件,以和HLA-Ⅱ和HLAⅠ-类分子结合能力为指标,分别对结核分枝杆菌RD1区9个编码蛋白进行T细胞抗原表位预测。[结果]通过预测,共获得和HLA-Ⅱ类分子结合的抗原表位1 580个和HLA-Ⅰ类分子结合的抗原表位336个。[结论]预测获得的T细胞抗原表位将对结核病特异性检测及新的结核疫苗研发起到借鉴作用。     

结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况预测及分析

[目的]对结核分枝杆菌RD1区T细胞表位分布情况进行预测和分析。[方法]利用NetMHC server生物信息学软件,以和HLA-Ⅱ和HLA-Ⅰ类分子结合能力为指标,分别对结核分枝杆菌RD1区9个编码蛋白进行T细胞抗原表位预测。[结果]通过预测,共获得和HLA-Ⅱ类分子结合的抗原表位1580个和HLA-Ⅰ类分子结合的抗原表位336个。[结论]预测获得的T细胞抗原表位将对结核病特异性检测及新的结核疫苗研发起到借鉴作用。     

盐芥EsABI1基因克隆及其功能预测

[目的]对盐芥EsABI1基因进行克隆及功能预测。[方法]克隆盐芥EsABI1基因c DNA序列,对其蛋白保守结构域和系统进化进行分析。[结果]EsABI1与At ABI1属于进化上的同一分支,有最近的亲缘关系,都含有包含PP2C蛋白磷酸酶催化活性位点在内的11个保守功能域。定量PCR检测发现,盐芥EsABI1沉默植株中EsABI1表达水平较野生型均有不同程度的降低。60μmol/L ABA分别处理EsABI1沉默植株0、3和6 h后,发现EsABI1基因表达水平受ABA诱导上调,而且相比于盐芥野生型,EsABI1沉默植株中EsABI1受ABA诱导上调表达更加明显。[结论]EsABI1是ABA信号转导途径中的负调控因子,参与了盐芥对环境胁迫的响应。     

SD大鼠佐剂性关节炎模型的建立与评估

目的 通过在不同组的SD大鼠尾部注射不同剂量的结核分枝杆菌H37Ra（Mtb）溶液,探索最佳致炎剂量,为类风湿关节炎大鼠的造模方法及基础研究提供理论依据。方法 采用灭活的Mtb与矿物油混匀,配制成浓度分别为0.625、1.25、2.5、5.0 mg/mL的佐剂,每组大鼠均给予相应浓度的MT悬浮液0.1 mL于尾根部皮下注射,诱导SD大鼠类风湿关节炎。在实验周期内,定期测量大鼠体质量,进行足爪容积测定、关节炎评分等,最后综合各项指标进行分析讨论,探讨得出最佳致炎剂量。结果 62.5 μg组不能充分诱导出关节炎,被剔除。125 μg组、250 μg组、500 μg组成功率均为100%,该3组关节肿胀程度、关节炎评分等无明显差异（P>0.05）,其中125 μg组大鼠关节受累范围和关节肿胀程度均轻于250 μg组和500 μg组。结论 由Mtb诱导的佐剂性关节炎大鼠模型造模成功率高,最佳致炎剂量可能为125 mg/mL,0.1 mL/只。     

结核分枝杆菌Erp蛋白PGLTS的4基序突变体的构建

以结核分枝杆菌H37Ra DNA为模板,通过PCR扩增,获得靶基因erp片段。采用重叠延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突变体,依次删除突变体的C-末端、N-末端和C/N-端,构建重组质粒p ET28a-C4、p ET28a-N4、p ET28a-CN4,转化BL21(DE3)p Lys S。对重组菌株IPTG诱导后的表达产物进行Tricine SDS-PAGE,得到大小分别约为11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析结果表明,目的蛋白表达特异。     

近年无锡市奶牛结核病的流行病学调查

<正>结核病是由结核分支杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病。牛结核病主要是由牛分枝杆菌所引起,主要特征为在多种组织器官形成干酪样坏死、肉芽肿(结核结节)和钙化结节病变。该病危害严重,被国际兽医局(OIE)列为B类动物疫病[1],我国列为二类传染病。本病可经呼吸道、消化道、交配等方式感染。在家畜中,牛最易感染结核病,尤以奶牛多见,其次是水牛和黄牛[2]。近年来,随着人们生活水     

延边黄牛副结核病超微结构变化的观察

用透射电子显微镜观察了2例有副结核症状及粪便检菌阳性的副结核病牛肠管粘膜固有层和肠系膜淋巴结皮质层超微结构变化。其结果:病牛肠管粘膜固有层的巨噬细胞浆内有数量不等的副结核分技杆菌存在,大多数细菌直接位于细胞浆内,而且形态结构完整,有些分枝杆菌存在于次级溶酶体内,菌体所在的巨噬细胞的细胞器有不同程度的破坏,吞噬菌体的巨噬细胞内的游离核糖体增多,粗面内质网扩张。病变部位肠管粘膜的微绒毛基本正常。肠系膜淋巴结皮质层巨噬细胞内的大多数细菌处于被破坏溶解的状态。肠粘膜固有层和肠系膜淋巴结内均有聚集增生的浆细胞。     

MTB感染对小鼠肺脏上皮细胞NF-κB和p53信号通路的调控

【目的】探讨在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染小鼠早期,其肺脏上皮细胞中NF-κB和p53信号通路参与机体的免疫调控作用。【方法】将C57BL/6 Cnc小鼠30只(雄、雌各15只),按5只/组设空白对照组、阴性对照组(腹腔注射生理盐水)和MTB感染组(腹腔注射牛结核分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)),感染4 d后经安乐死处死小鼠,摘取小鼠肺脏和脾脏进行形态学观察;将小鼠肺脏进行冰冻超薄切片,HE染色分析其肺脏病理变化;利用免疫组织荧光技术和激光共聚焦显微镜,标记SP-C阳性肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的位置,观察NF-κB和p53蛋白在肺泡上皮细胞中的表达情况。提取小鼠肺脏组织细胞总蛋白,以β-actin为内参,通过Western blot分析NF-κB和p53信号通路相关因子TLR4、TRAF6、NF-κB、p53、MDM2和CBP在蛋白水平上的变化。【结果】在MTB感染小鼠4 d后,小鼠肺脏形态无明显变化,脾脏1/3尖部瘀血变黑;HE染色发现肺脏组织炎性细胞浸润。在小鼠肺脏上皮细胞中NF-κB与p53蛋白免疫荧光表达较空白对照组和阴性对照组增强。TLR4、NF-κB、p53、MDM2和CBP蛋白在雄性与雌性小鼠中都呈现出显著上调。【结论】当结核分枝杆菌感染小鼠时,小鼠肺脏上皮细胞通过NF-κB和p53信号通路活化来参与宿主抗结核分枝杆菌病感染的免疫调控作用。     

猪miR-124靶向IQGAP2调节巨噬细胞内沙门氏菌的增殖

[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖.     

结核分枝杆菌酯酶Rv1400c原核表达及表达产物的酶活性分析

为探究结核分枝杆菌酯酶Rv1400c活性,以进一步研究Rv1400c的结构和功能。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,对Rv1400c基因进行扩增,并将其克隆到p ET28b(+)原核表达载体上,构建p ET28b-Rv1400c重组质粒,然后将构建的重组质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,增菌后用IPTG进行诱导表达再用亲和层吸树脂法进行纯化,利用不同底物、不同p H、不同温度对纯化后的Rv1400c酯酶进行活性分析。结果表明:成功构建出p ET28b-Rv1400c重组质粒;SDS-PAGE和Western blot显示,Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;在对8种底物的筛选中发现Rv1400c在C2~C14中具有活性,其中以在C2中活性最好;在以C12为底物、p H 8.0、37℃条件下酯酶活性最高。     

猪肺泡巨噬细胞中长链非编码RNA在副猪嗜血杆菌感染中的作用

[目的]副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪上呼吸道中常见的革兰氏阴性胞外菌,能在应激条件下引起猪格拉瑟氏病,本试验旨在探索副猪嗜血杆菌与宿主之间的相互作用。[方法]用标准血清型5型副猪嗜血杆菌(Hps5)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21),通过RNA-Seq检测长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA的表达。[结果]共鉴定出2 654个lncRNA,其中包含2 439个基因间lncRNA(lincRNA)和159个反义lncRNA(anti-sense lncRNA)。与对照组相比,感染细胞中有110个lncRNA上调,216个lncRNA下调。RT-qPCR结果证明RNA-Seq鉴定的10个上调的lncRNA在Hps5感染的3D4/21细胞中稳定上调。在12、24和36 h时,有4个lncRNA持续上调。特别是lncRNA 165和3304的上调与细胞对活细菌的吞噬作用有关,但未发现lncRNA 165、3304的表达与细菌毒力之间的关系。RNA干扰和过表达试验表明,lncRNA 165能够通过调节TGF-β1的表达来影响副猪嗜血杆菌的吞噬作用。[结论]lncRNA 165在3D4/21细胞中通过TGF-β通路调控对副猪嗜血杆菌的吞噬中起重要作用。