拟轮枝镰孢荧光标记与侵染结构观察

【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体p COM-GFP、p COM-Ds RED、p COM-Ds RED-PTS1和p COM-Life Act-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP...     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

玉米种子内部拟轮枝镰孢菌抗性的QTL定位

为探究玉米种子内部对拟轮枝镰孢菌的抗性,利用由抗病自交系BT-1与感病自交系N6构建的RIL群体为材料,进行4个环境的联合QTL分析。结果表明,6个控制种子内部对拟轮枝镰孢菌抗性的QTL分布在第1、3、4、9、10染色体上,表型贡献率介于1.32%～7.62%。其中,表型贡献率最高的QTL qSIR3-1位于第3染色体,解释7.62%的表型贡献率,抗病效应来自于抗病亲本BT-1。6个QTL中的1个与已知种子外部抗性QTL一致,表明玉米种子内部对拟轮枝镰孢菌的抗性是独立的性状。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和m Cherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和m Cherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。     

东北地区玉米穗腐镰孢菌种类鉴定及拟轮枝镰孢菌遗传多样性

为明确东北地区玉米穗腐病致病镰孢菌的种类及拟轮枝镰孢菌的多样性,于2015~2016年在东北4个省30个区县进行玉米穗腐病样品的采集,通过形态学及分子生物学方法对分离获得的镰孢菌的种类进行鉴定,并用ISSR分子标记技术对40株拟轮枝镰孢菌进行遗传多样性分析。结果表明:在获得的122株镰孢菌分离物中鉴定出包括禾谷镰孢菌、层出镰孢菌、亚粘团镰孢菌和拟轮枝镰孢菌共4个种,其分离频率分别为4.92%、7.38%、10.66%和77.05%。从区域分布来看,拟轮枝镰孢菌的分布最广,在所有采样县区均有分布。在30个县区采集的玉米穗腐病样品中,有7个县区分离到亚粘团镰孢菌,有5个县区分离到层出镰孢菌,有2个县区分离到禾谷镰孢菌,分别占采集县区样本的23.33%、16.67%和6.67%,说明拟轮枝镰孢菌是东北地区玉米穗腐病的优势致病菌。ISSR-PCR结果表明,筛选出的8条ISSR引物共扩增出45条清晰条带,其中27条为多态性条带,不同引物对供试菌株扩增的条带数不同,引物842扩增的条带最多,引物873扩增的条带最少,多态性条带的比例分别是66.7%和50%。聚类分析结果表明,供试菌株间的遗传相似系数为0.75~1.00,当遗传相似系数为0.97时,供试菌株被全部分开。拟轮枝镰孢菌ISSR类群的划分与其地理来源没有明显的相关性。     

基于宿主诱导的基因沉默技术创制抗拟轮枝镰孢玉米自交系

【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T₂代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。     

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一,论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异,为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序,之后采用生物信息学分析,分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考,以|log₂FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因,利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1 945个基因上调表达,有9、302和1 784个基因下调表达;玉米分别有293、692和1 426个基因上调表达,320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示,侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,差异基因主要富集在...     

芽孢杆菌抑制玉米茎腐病菌禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌的研究进展

玉米茎腐病是由一种或多种真菌、细菌单独或共同侵染引起玉米根腐、茎腐、鞘腐以及穗腐等症状的世界性顽疾,部分病原还能产生真菌毒素,严重影响玉米的产量和质量。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是已知的最具潜力的生防菌之一,且在自然界中分布十分广泛。深入了解生防芽孢杆菌的抗菌活性物质及抑菌机制,对玉米茎腐病的绿色防控具有重大意义。本文重点阐述对玉米茎腐病具有生防作用的芽孢杆菌种类、防效、防控机制,及相关混合菌剂的应用现状。生防芽孢杆菌菌体悬液、发酵液和无菌发酵液对病原菌均具有一定的抑菌效果。其中,甲基营养型芽孢杆菌TA-1的发酵液防效最佳,且对玉米具有促生长作用;蜡样芽胞杆菌B25菌体悬液浸种后显著降低了鲜玉米粒中伏马菌素的含量;贝莱斯芽孢杆菌BV23对玉米多种病原均有抑制作用;在室内及大田中解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2发酵液均较菌体悬液和无菌发酵液的抑制效果好。多数芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌物质能破坏细胞膜和细胞壁的完整性,导致禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌菌丝畸形、顶端囊泡化,细胞膜通透性增强,细胞质渗漏,从而抑制病原菌菌丝生长、孢子产生以及孢子萌发;此外,脂肽类活性物质还能使病原菌DNA二...     

基于图像分析的玉米抗拟轮枝镰孢穗腐病的QTL定位

[目的]玉米穗腐病是一种在全世界广泛发生且危害严重的真菌性病害,其中,拟轮枝镰孢引起的穗腐病(Fusariumear rot,FER)在中国发生最为普遍.通过图像分析方法进行FER抗病QTL定位,并对前期通过病害评级方法定位的FER抗病QTL进行验证,探索一种新的玉米穗腐病的病害鉴定方法,为玉米穗腐病的遗传改良提供依据...     

拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽及幼苗生长的影响

为建立玉米杂交种和自交系利用拟轮枝镰孢菌毒素抗性筛选的试验方法,制备拟轮枝镰孢菌毒素粗提液,测定不同稀释倍数毒素粗提液对2个玉米杂交种和4个玉米自交系处理4和6 d后的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率以及幼苗致萎效果,分析不同抗性玉米种质、毒素稀释倍数和处理时间对玉米种子发芽、胚根和幼苗生长的影响。结果表明,易感杂交种豫玉22与抗性杂交种农大108的种子发芽抑制率和胚根生长抑制率均存在极显著差异(P<0.01);在处理后4、6 d时,前者的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率分别比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在对玉米杂交种幼苗致萎蔫试验中,用稀释2倍和5倍的毒素粗提液处理,豫玉22与农大108杂交种幼苗间的萎蔫程度也存在显著差异(P<0.05)。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对不同抗性玉米种质种子发芽、幼苗生长的影响存在显著差异,为利用拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米品种进行苗枯病抗性鉴定和筛选提供理论依据。     

鲜食甜、糯玉米自交系对拟轮枝镰孢菌穗粒腐病的抗性鉴定

以形态学和分子生物学为基础,对鲜食甜、糯玉米穗粒腐病样品中致病菌拟轮枝镰孢菌进行分离鉴定。针对37份不同来源的鲜食甜、糯玉米自交系种质材料,采用针刺注射果穗接种法进行人工接种拟轮枝镰孢菌,并对其抗性进行鉴定。结果表明:不同鲜食玉米自交系种质的抗病性差异较大,Hw53、Hw71、Hw175、Ht219和Ht253共5份自交系对拟轮枝镰孢菌表现为高抗,而Hw61、Hw144、Hw145等10份自交系对该致病菌表现为高感。在22份糯玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现感病的种质有8份,占参试糯玉米自交系种质总数的36.36%;在15份甜玉米自交系种质中,对拟轮枝镰孢菌表现感病的种质有7份,占参试甜玉米自交系种质总数的46.67%,甜玉米相对糯玉米更易感染穗粒腐病。该研究结果可为鲜食甜、糯玉米穗粒腐病的综合绿色防治及抗性品种选育提供一定的理论依据。     

化学防控玉米蛀穗害虫对减轻拟轮枝镰孢穗腐病及伏马毒素的作用

[背景]拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的穗腐病严重影响玉米产量和品质,其产生的伏马毒素威胁食品安全.亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和桃蛀螟(Conogethes punctiferalis)等穗期害虫危害可导致玉米严重减产,并加重玉米穗腐病的发生.[目的]评估2...     

水稻品种恶苗病抗性快速鉴定方法研究

对2个籼稻（TN1,中组3号）和2个粳稻（春江06,浙粳27）品种用不同浓度的恶苗病菌室内接种处理,根据秧苗徒长长度的变化来确定其抗性水平。研究结果表明,4个品种中,春江06抗性最强,而中组3号最易感病,浙粳27和TN1抗性水平相当。     

水稻恶苗病的研究进展

分别从病原菌的生物学特性、病原菌的抗药性、品种抗性、病害发生规律、影响因子、致病生理生化以及防治药剂的筛选等方面综述了水稻恶苗病的研究进展.     

水稻恶苗病的防治

本病又叫徒长病、白秆病、标茅稻、抡先稻、望水白等,曾在我国主要稻区都有发生,后随着生产的发展,在大规模谷种消毒的基础上,已基本控制其危害,但在有些地区有时仍有发生。     

禽流感病毒LAMP快速诊断方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为967%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。     

水稻恶苗病的防治

水稻恶苗病从苗期到抽穗期均可发生。恶苗病的病菌寄生或附着在种子上以及土壤中,种子带菌是恶苗病发生发病的主要原因。重病种子往往不能发芽,或萌发以后幼苗即可死亡。轻病的种子长出的病苗徒长,比健株高