温度对果梅离体花柱S-RNase识别特异性的影响

 【目的】研究不同温度对果梅花柱S-RNase降解花粉管RNA的影响,为揭示果梅自交不亲和性机制提供依据。【方法】在液体培养基中添加从果梅‘月世界’花柱中纯化的S-RNase,并分别于10℃、25℃和35℃条件下培养自花（‘月世界’）、异花（‘莺宿’）花粉,测定不同培养时间后的花粉萌发率和花粉管生长长度;离体条件下进行果梅花柱S-RNase降解花粉管RNA反应后,用琼脂糖凝胶电泳检测不同温度条件下自花、异花花粉管RNA被降解的程度。【结果】10℃、25℃时,花柱S-RNase抑制自花花粉萌发和花粉管生长的程度极显著大于抑制异花花粉的程度;花柱S-RNase降解自花花粉管RNA的程度也明显大于降解异花花粉管RNA的程度;温度升高到35℃时,自花和异花间花粉萌发和花粉管生长被花柱S-RNase抑制的程度不存在显著性差异;花柱S-RNase降解自花和异花花粉管RNA的程度也相似。随着反应温度的升高,花柱S-RNase较大程度抑制自花花粉萌发和花粉管生长的特异性及较大程度降解花粉管RNA的特异性逐渐减弱,当温度达到35℃时,该抑制特异性和降解特异性消失。【结论】果梅花柱S-RNase特异性识别并降解自花花粉管RNA,导致自花花粉管停止生长;随着温度的升高花柱S-RNase对花粉管RNA的识别特异性减弱,从而调节果梅的自交不亲和性反应。     

离体条件下微丝骨架解聚剂和稳定剂对梨自交不亲和性花粉萌发和花粉管生长的影响

以2个自交不亲和性梨品种“今村秋”和“丰水”为试材,在离体条件下通过花粉培养试验研究了不同浓度的微丝稳定剂鬼笔环肽（phalloidin）和微丝抑制剂细胞松弛素B（cytochalasin B）对梨花粉萌发率和花粉管长度的影响。结果表明：1）低浓度（10μg／ml）鬼笔环肽能促进花粉萌发和花粉管生长,但高浓度对花粉萌发和花粉管的生长具有抑制作用;细胞松弛素B抑制花粉萌发和花粉管生长,并且抑制效果随着浓度的增加而增强。2）细胞松弛素B和异花花柱S糖蛋白（S-Rnase）共同处理抑制了花粉萌发和花粉管生长,而一定浓度的鬼笔环肽能恢复自体花柱S糖蛋白对花粉萌发和花粉管生长的抑制作用。结果表明微丝骨架参与了梨花粉萌发及花粉管生长的过程,并可能参与了梨自交不亲和反应过程。     

NEM对川百合花粉萌发和花粉管伸长的抑制效应

为探明微丝骨架结构以及微丝骨架对花粉萌发和花粉管伸长的作用,采用不同浓度的巯基类化学反应试剂NEM处理川百合花粉。结果表明:30μmol/L NEM能有效抑制川百合花粉萌发和花粉管伸长,抑制率分别达到95%和99%;经20μmol/L NEM处理过的川百合花粉,在去掉NEM后,其萌发率恢复到对照(0μmol/L NEM)的98%,花粉管长度恢复到对照(0μmol/L NEM)的60%;15μmol/L、20μmol/L和30μmol/L NEM处理过的川百合花粉,其花粉管内微丝排列呈弯曲状;而非沿纵轴向顶端延伸的正常微丝束状态。可见,NEM作为一种微丝骨架的抑制剂改变了花粉管中微丝骨架的分布结构,影响了花粉管的生长。     

大果黄花梨自交亲和性变异机制研究

梨品种大果黄花由黄花芽变而来.田间授粉试验表明,黄花梨自花授粉结实率仅为1.5%,属于梨自交不亲和性品种;而大果黄花自花授粉的结实率高达60.0%,属于自交亲和性品种;相互授粉时,黄花×大果黄花组合的坐果率达70.0%,为杂交亲和,但反交时坐果率为1.0%,表现为杂交不亲和.荧光显微镜观察这些组合授粉后花柱内花粉管生长情况,也得到相同的结果.这些结果表明,两品种雌蕊的自交不亲和性性状正常.进一步鉴定出了黄花和大果黄花是基于S-RNase基因的S-基因型,发现两者均含有S1-RNase和S2-RNase基因;而且两品种的这1对雌蕊S-RNase基因均特异性地在花柱中表达,表达量没有明显差异,表明大果黄花和黄花的雌蕊S-RNase基因并无差异.由此推断:大果黄花的自交亲和性突变,是由于花粉自交不亲和性功能丧失,从而表现出自花授粉能够结实.     

大果黄花梨自交亲和性变异机制研究

梨品种大果黄花由黄花芽变而来.田间授粉试验表明,黄花梨自花授粉结实率仅为1.5%,属于梨自交不亲和性品种;而大果黄花自花授粉的结实率高达60.0%,属于自交亲和性品种;相互授粉时,黄花×大果黄花组合的坐果率达70.0%,为杂交亲和,但反交时坐果率为1.0%,表现为杂交不亲和.荧光显微镜观察这些组合授粉后花柱内花粉管生长情况,也得到相同的结果.这些结果表明,两品种雌蕊的自交不亲和性性状正常.进一步鉴定出了黄花和大果黄花是基于S-RNase基因的S-基因型,发现两者均含有S1-RNase和S2-RNase基因;而且两品种的这1对雌蕊S-RNase基因均特异性地在花柱中表达,表达量没有明显差异,表明大果黄花和黄花的雌蕊S-RNase基因并无差异.由此推断:大果黄花的自交亲和性突变,是由于花粉自交不亲和性功能丧失,从而表现出自花授粉能够结实.     

烟草BY-2细胞和蚕豆叶肉细胞原生质体微丝骨架及latrunculin B处理对其分布的影响

用酶解法分别制备烟草BY-2悬浮培养细胞和蚕豆叶肉细胞的原生质体,应用激光共聚焦显微镜观察经TRITC-鬼笔环肽荧光染色的2种原生质体的微丝骨架空间分布,以及观察用10和20μmol·L-1微丝抑制剂latrunculin B分别处理2种原生质体后对其分布的影响.结果表明:激光共聚焦显微镜清楚地显示出2种细胞原生质体中微丝精细排列的均匀网络结构;共聚焦显微成像显示了随latrunculin B处理时间的延长微丝解聚和微丝骨架分布的动态过程.建立原生质体制备、微丝骨架荧光染色、latrunculin B处理及激光共聚焦显微观察的实验体系为进一步研究植物微丝骨架的功能奠定了基础.     

16个枸杞品种(系)S-RNase基因型鉴定及序列分析

【目的】以16个枸杞品种(系)为试材,进行S-RNase基因型鉴定。【方法】利用茄科S基因高度保守区序列设计兼并引物,进行PCR扩增,片段回收、克隆及同源性检索和序列分析,同时,通过田间授粉测定自交亲和指数进行验证。【结果】11个品种(系)为自交不亲和材料,5个为自交亲和材料。共克隆9个S-RNase等位基因,分别为S-BARB2、S-BARB3、S-BARB6、S-BARB8、SBARB9、S-CHIN3、S-CHIN6,并发现2个新的S等位基因,分别命名为S-BARB6n,S-PUMI5un。所克隆获得的9个枸杞S-RNase等位基因均包含了C2、C3、C4保守区,和2个高变异区(Hva和HVb)。【结论】枸杞属植物存在S-RNase等位基因,其基因序列与茄科植物具有一定相似性,枸杞S-RNase基因是控制枸杞自交不亲和性的关键基因。     

梨内源与外源核糖核酸酶对花粉萌发及花粉管生长的影响

 将从沙梨(Pyrus　pyrifolia)花柱中分离出的 RNase(内源 RNase)和外源RNase　添加于花粉萌发培养基培养二十世纪梨花粉。结果表明,低活性量(0.006　U)的RNase 对花粉萌发及花粉管生长的抑制作用弱;较高活性量(0.010 U)的RNase　T 对花粉萌发及花粉管生长的抑制作用最强,其次为二十世纪花柱S-RNase　和RNase 1A;新水花柱S-RNase对花粉管生长抑制作用最弱;在添加这4种RNase的培养基中,二十世纪花粉管生长的长度分别是对照花粉管长度(410　μm)     

粉蓝烟草（Nicotiana glauca）花柱S-RNase的活性及其表达特异性研究

报道了粉蓝烟草自交不亲和性花柱S-基因产物的性质及时空表达特征。花柱S-基因产物是一种特异的糖蛋白（即S-糖蛋白）,具有极高的Rnase活性,因此又称S-Rnase。#+（32）P标记花粉RNA实验显示,授粉48h后,亲和性花粉管已生长进入子房,而自交不亲和性花粉管的rRNA含量急剧降低,并在花柱上半部特定区域停止生长。由此可推知,花柱S-Rnase通过与自交花粉管特异性识别进入管内分解rRNA,使花粉管蛋白质合成受阻,最终导致自交不亲和性反应。     

微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用

 【目的】阐明微丝骨架在小麦非寄主抗病性中的作用。【方法】以小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作体系为研究对象,通过台盼蓝、DAB和考马斯亮蓝染色法研究了小麦叶片经微丝骨架解聚剂处理后过敏性坏死、H2O2及乳突形成的变化。【结果】黄瓜白粉菌在小麦叶面上萌发明显滞后且附着胞多畸形。药剂处理后,过敏性坏死反应和H2O2的产生及乳突的形成均明显受抑,产生率均显著降低。白粉菌的侵入率明显提高,并且能形成吸器,偶尔还产生次生菌丝。【结论】微丝骨架参与了小麦的非寄主抗病性反应,骨架的聚合为抗病性反应的发生所必须。     

铁皮石斛自交和杂交亲和性的细胞学研究

为了探讨铁皮石斛Dendrobium officinale自交和杂交亲和性的生物学机制,利用荧光显微镜观察铁皮石斛自交、种内杂交后柱头性状和花粉管的生长情况。结果发现:自花授粉1 h后,花粉粒萌发,花粉管到达花柱基部接近子房处,4 h后花粉管进入子房,8 h后停止生长,72 h后子房萎缩,花粉管消失,不同的亲本间略有差别。种内杂交后的花粉管能够顺利进入子房,发育良好。由于铁皮石斛自交花粉管进入子房后停止生长,导致子房萎缩,可以认为铁皮石斛属于配子体自交不亲和。研究结果为铁皮石斛的自交不结实机理研究提供了细胞学基础,也为铁皮石斛种质资源保育、杂交育种等研究提供理论依据。     

梨自交花粉原位萌发观察及不亲和性强度研究

梨是世界四大水果作物之一,拥有特殊的自交不亲和特性。这种现象在蔷薇科中普遍存在,但关于不同品种的自交不亲和强度却鲜有报道。综合田间自花授粉套袋试验及花粉管原位荧光显微观察,对256个不同梨品种进行套袋处理、花粉管生长特性观察、自交不亲和性强度统计分类以及坐果率调查。结果显示:自交不亲和性较强品种的花粉管虽然有少量穿过柱头,但不能在花柱内进一步生长,表现为扭曲变形、花粉管杂乱无章,以及花粉管末端变粗膨大等现象。不同梨品种自交不亲和性强度R值参差不齐,所调查的大部分梨品种自交不亲和强度分布在强与中之间,分别占57.4%、33.6%,而自交不亲和性弱的只占9.0%,仅有闫庄鸭梨、秋荣、54S-135、金坠、大果黄花和晚秀7个品种。田间自花授粉坐果率调查发现,自交不亲和性强度为强与中的品种的结实率基本为0,弱自交不亲和性强度品种金坠、秋荣的结实率分别为61.4%、32.7%,但晚秀表现出自交不结实。研究结果不仅具有理论价值,而且有潜在的实践意义。     

苹果属S-RNase基因的进化研究

【目的】通过分析苹果属植物自交不亲合性位点S-RNase基因的序列,研究S-RNase基因在苹果属的进化历史,序列分歧特点和遗传多态性。【方法】利用栽培苹果的S-RNase基因序列在GenBank数据库中检索和鉴定所有已知的苹果属植物的S-RNase基因,同时利用S-RNase基因的保守引物获得陇东海棠和变叶海棠的S-RNase基因序列。通过系统发育分析研究S-RNase基因的进化历史,进而计算dN/dS比值揭示S-RNase基因序列分歧的特点,最后估计并比较苹果属不同类群S-RNase基因的遗传多态性及其遗传分化。【结果】苹果属植物的S-RNase基因可以分为16个亚类,同一亚类S-RNase基因的序列分歧较小,亚类之间的分歧很大。S-RNase基因的成对dN/dS比值中有50%的大于1,并且滑动窗分析显示S-RNase基因具有多个dN/dS比值显著大于1的区域。栽培苹果和野生苹果在S-RNase基因的遗传多态性上没有明显差异。在所涉及的苹果属野生类群中,栽培苹果与塞威士苹果在S-RNase基因上的遗传分化最小。【结论】适应性氨基酸替换在苹果属植物S-RNase基因的序列分歧上发挥了重要作用。现有的S-RNase基因数据显示栽培驯化没有导致栽培苹果S-RNase基因遗传多态性的降低,基于S-RNase基因的遗传分化支持栽培苹果是由塞威士苹果驯化而来的观点。     

甘蓝自交不亲和性的快速测定

利用荧光显微镜观察经过处理的甘蓝自花授粉花期柱头和蕾期柱头 ,发现花粉粒在柱头上的萌发及花粉管在柱头表面和花柱中的生长情况有很大差异。自交不亲和系花期柱头有少量的花粉粒萌发 ,并在柱头表面发生严重的胼胝质反应且花粉管的形态不正常 ,要么弯曲、要么背向生长 ,不能穿越乳突细胞壁 ;而自交亲和系花期、蕾期和自交不亲和系蕾期的柱头上 ,花粉粒几乎都能萌发长出花粉管 ,并能穿过花柱到达子房。利用荧光显微镜观察花柱中的花粉管数量可以省时、省工、直观快速鉴定甘蓝自交不亲和性     

红心柚‘橘湘红’无核原因初探

以红心柚‘橘湘红’为材料,安江香柚为对照,通过物候期和花器特征的观察、花粉活力的测定、自交和异交花粉管在柱头中的生长及果实种子差异分析,探讨‘橘湘红’无核的原因。结果表明:‘橘湘红’的物候期与对照仅相差2~3 d,花器发育均正常;‘橘湘红’、安江香柚花粉在柱头上的萌发率分别为98.81%、97.96%,花粉活力分别为96.75%、94.61%,可育性高;自交与异交授粉96 h后,花粉管生长开始出现差异,自交花粉管生长速度减缓,异交花粉管生长正常,授粉120 h后,自交的花粉管停滞生长,异交的花粉管生长到达花柱基部;‘橘湘红’异花授粉平均每个果实有正常种子103.8粒,自花授粉果实无正常发育的种子。综合分析认为自交不亲和性可能是‘橘湘红’无核的主要原因。     

11个中国杏品种S-RNase基因的检测与序列分析

以11个未知基因型的中国杏品种为试材,根据李属植物S-RNase基因保守区设计2对引物组合检测各品种S-RNase基因,共获得22条等位扩增片段,电泳检测表明所有品种的扩增条带集中在300~1100bp的范围内,且表现出一定的长度多态性。序列分析进一步确定22个S-RNase基因为10个不同的等位基因,其中6个为首次发现,根据Gen-Bank中已登陆的杏S-RNase基因的顺序,分别命名为S19、S20、S23、S24、S25、S26,序列登陆号为:EF185300、EF185301、EU037262、EU037263、EU037264、EU037265。推导氨基酸序列的同源分析表明,杏的S-RNase与李属植物的S-RNase表现较高的同源性,为59.3%~100%;与苹果和梨的S-RNase同源性较低,为19.6%~31.6%。试验确定11个中国杏品种资源的自交不亲和基因型分别为:‘大果杏’S19/S20,‘张公园’S24/S25,‘二红’S9/S11,‘黄口外’S11/S26,‘植丸子’S11/S17,‘宇宙红’、‘大丰’S17/S23,‘超仁’、‘虹桥’S8/S11,‘冀光’、‘中华大杏梅’S8/S9;部分品种的田间杂交授粉座果与花粉管荧光显微镜观察证实了所鉴定基因型的可靠性。     

君子兰自交不亲和性及自交不亲和机理

以大花君子兰为材料,研究君子兰的自交不亲和性及作用机理。采用套袋自交法测定君子兰自交亲和指数;采用荧光显微镜观察法研究自交不亲和机理。结果表明:君子兰同花自交亲和指数0.29,同株自交亲和指数3.43,种内自交亲和指数10.15。由此总结出君子兰同花自交和同株自交具有自交不亲和性,胼胝质主要出现在花粉管中,属配子体不亲和性。     

EGTA对‘秦冠’苹果花粉管Ca2+、微丝分布以及囊泡运输的影响

【目的】研究Ca~(2+)螯合剂EGTA对花粉萌发和生长过程中花粉管形态、Ca~(2+)分布、细胞骨架和胞内运输的影响。【方法】以Ca~(2+)螯合剂EGTA处理‘秦冠’苹果成熟花粉,显微镜观察其对花粉萌发、花粉管生长的影响。运用免疫荧光标记技术结合荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜观察花粉管内Ca~(2+)分布、微丝分布和囊泡运输模式。【结果】发现低浓度的EGTA对花粉萌发和花粉管生长影响很小,甚至有促进作用。用较高浓度的EGTA处理花粉后,花粉萌发和花粉管生长均受到明显抑制,花粉粒甚至不萌发,花粉管有扭曲膨大短小等现象。用400μmol/L EGTA处理花粉后,花粉管顶端钙离子内流稍有增加,用2mmol/L EGTA处理后,花粉管顶端钙离子交换被抑制。用400μmol/L EGTA处理后,花粉管内游离Ca~(2+)在花粉管顶端聚集并呈现浓度梯度分布,与对照的分布模式一致,而用2mmol/L EGTA处理后顶端聚集模式消失。对照和400μmol/L EGTA处理后花粉管内微丝与花粉管生长方向平行排列,而用2 mmol/L EGTA处理后花粉管内微丝断裂、丝状结构不明显,无序分布在花粉管内。对照花粉管内囊泡运输在顶端以及近顶端区域聚集,用400μmol/L EGTA处理后分布模式变化不大,而用2mmol/L EGTA处理后,囊泡运输增加,布满整个花粉管内。【结论】钙可能作为一种信号因子,通过影响细胞骨架的构成和胞内囊泡的运输模式,从而调节苹果花粉的萌发及花粉管生长。     

萝卜自交不亲和特性的荧光快速鉴定

以萝卜高代自交系为材料,利用荧光显微镜观察其花期和蕾期自花授粉的柱头与花柱,结果发现自交不亲和与自交亲和材料花粉萌发和花粉管伸长状况存在明显差异.自交不亲和材料花期授粉后柱头上出现严重的胼胝质反应,花粉很少萌发,即使萌发也不能正常生长,出现弯曲或背向生长,花粉管顶端膨大不能穿越柱头乳突细胞;自交亲和系萝卜单株花期、蕾期以及自交不亲和系单株蕾期授粉后花粉多数能够正常萌发并穿越柱头进入子房.对供试材料进行了田间自交亲和指数测定,结果与荧光显微镜测定法鉴定结果高度一致.因此利用荧光显微镜观察法可以准确快速鉴定萝卜的自交不亲和性,从而提高优良自交不亲和系选育效率.     

枸杞自交不亲和基因型（S基因）研究进展

枸杞是典型的配子体型自交不亲和经果林树种,生产上授粉树的合理选配及杂交亲本的优良组合均受限于自交亲和指数及S-RNase基因。本文系统介绍了运用杂交授粉试验、蛋白质产物分析、c DNA克隆技术、DNA序列分析和靶向测序基因型分型技术等确定枸杞自交不亲和基因型的研究进展,总结运用不同技术研究枸杞自交不亲和性的成果并对比分析各技术的优点和不足,以期为枸杞遗传育种研究提供有价值的参考,为生产上合理选配授粉树提供基础理论依据。