猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定与生物学特性研究

从黑龙江省大庆市某猪场采集流产的仔猪脑组织、扁桃体等病料接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,用PCR法、血清中和试验及直接免疫荧光法等方法进行鉴定,并对病毒滴度、对兔和15日龄仔猪的致病力、对热、胰蛋白酶、氯仿以及乙醚的敏感性等生物学特性进行测定.结果表明:PCR法能扩增出217 bp的基因片段,与预期目的条带一致;病毒能被伪狂犬病毒阳性血清所中和,直接免疫荧光法结果呈阳性;经克隆纯化后测定其病毒滴度为107.36 TCID50/0.1 mL,对兔和15日龄仔猪有较强的致病力,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感.鉴定结果表明,该病毒为猪伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株.     

猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种的Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为60%,接种PK-15细胞出现拉网病变,猪的狂犬病毒阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(genebank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

猪伪狂犬病毒分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,死亡率为50%,接种Vero出现拉网病变;伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)阳性血清能特异中和该分离毒;根据基因库(genebank)的PRV gD基因(AY169694)设计的引物能扩增出特异性片段.以上结果证实该病毒为伪狂犬病毒.     

一例猪伪狂犬病毒的分离和鉴定

从病猪肾脏分离到1株病毒,该病毒接种Palb/c小鼠出现神经症状,死亡率为60%,接种PK-15细胞出现拉网病变,阳性血清能特异性的中和该分离病毒,根据基因库(genebank)的PRVgE基因设计的引物能扩增出特异性片段。以上结果证实该病毒为伪狂犬病毒。     

猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及其毒力试验

本研究采集了猪伪狂犬病阳性样品,通过PK-15细胞对PRV流行毒株进行了分离培养、纯净性检验、中和试验鉴定、遗传进化分析和仔猪毒力试验,对我国当前流行的猪伪狂犬病毒的遗传变异与毒力变化情况进行了分析。通过病毒分离鉴定共获得6株猪伪狂犬病毒,其中SCY1株、HBA1株、JXN1株存在支原体或PCV2污染,SCHS株、SCM1株、JXHS株无外源污染,并能被猪伪狂犬病毒特异性血清中和。6个分离毒株的gB基因片段与JS-2012株的同源性为99.7%～100%,与Bartha K61株的同源性约为95%;g C基因片段与JS-2012株的同源性为99.5%～100%,与Bartha K61株的同源性为90.7%～91.2%;gD基因与JS-2012株的同源性为99.8%～100%,与Bartha K61株的同源性在98.7%～98.9%之间;gE基因与JS-2012株的同源性在99.1%～99.8%之间。用3株纯净毒株感染8～9周龄PRV抗体阴性仔猪后全部出现体温升高,部分试验猪出现呼吸道症状并死亡。试验结果表明,本次分离的猪伪狂犬病毒与我国当前流行毒株的遗传关系接近,但不同毒株的毒力存在一定差异。     

猪伪狂犬病毒CC株的分离与鉴定

从吉林省长春市某猪场送检的一头发热、流涎、肌肉痉挛、角弓反张的9日龄仔猪中分离到一株病毒。该病毒能在猪肾细胞(PK-15),仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖并产生典型的细胞病变(CPE),从流行病学,临床症状和病理变化均与伪狂犬病相似,该病毒能被伪狂犬病毒阳性血清中和,电镜观察可见椭圆形、直径为110-180nm典型疤疹病毒粒子,用该病毒接种家免和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。经鉴定,证明此病毒确为伪狂犬病病毒(PRV),并将该病毒命名为PRVCC株。     

猪伪狂犬病病毒的分离和鉴定

从病猪脑部分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,病死率为60% ,接种PK-15细胞出现拉网病变.伪狂犬病阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(GenBank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,证实该病毒为伪狂犬病病毒.     

猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定

从河南省某规模化猪场的死亡仔猪中分离到1株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为ZY-2014株,并对其进行了PCR鉴定、g E基因序列分析、动物感染试验等鉴定。病毒经vero细胞培养可产生典型细胞病变,用Reed-Muench法测定病毒的滴度为107.4TCID50/100μL。分离病毒基因组DNA经过g D、g E、g G、三对特异性检测引物扩增后,均出现伪狂犬病毒特异性目的条带,分别为217 bp、636 bp、1440 bp。测序结果与预期结果相符。将ZY-2014毒株g E基因测序结果与10个新分离毒株、14个经典毒株进行同源性比对分析,其核苷酸及推导的氨基酸序列与国内2012年以来新分离毒株的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~100%,与2012年以前分离毒株核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%~99.6%和95.7%~99.3%。遗传进化树结果显示,所分离的ZY-2014毒株与2012年以来新分离毒株同属一分支,与经典毒株分属不同进化分支。动物攻毒试验中,家兔和小鼠均出现明显的伪狂犬病临床症状。鉴定试验表明,分离株ZY-2014是一株猪伪狂犬变异毒株。     

猪伪狂犬病毒京A株的分离及鉴定

用细胞培养方法从北京某猪场一死亡仔猪中分离到1株伪狂犬病毒,定名为京A株。该病毒可在乳兔肾原(次)代细胞或兔肾传代细胞上繁殖继代,并产生明显的细胞病变(CPE);接种家兔则呈现以奇痒为特征的神经症状并导致死亡;病毒能被伪狂犬特异性血清中和;电镜观察,病毒粒子呈圆形,有囊膜及纤突,直径120—150nm,部分粒子尚可见到核衣壳。     

伪狂犬病毒SN株、SL株的分离鉴定

对琼扩试验检测为伪狂犬病毒 (PRV )阳性的病料 ,采用MDBK细胞进行病毒分离培养 ,获得了两株PRV ,进而经家兔接种和核酸杂交鉴定为PRV阳性 ,将其分别命名为PRVSN株、SL株。     

伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

广西陆川某猪场猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及gE基因的分析

为了确诊猪伪狂犬病病毒(PRV)的感染,探讨目前广西猪群中流行的PRVgE基因的变异特征,为更好地防控猪伪狂犬病(PR)提供参考依据,本研究采集了广西陆川某猪场保育猪群发生呼吸道症状的肺脏组织,并用Vero细胞进行病毒分离,应用PCR方法对分离株的gE基因进行克隆和测序,根据测序结果证实分离到1个PRV毒株,命名为GXLC1。分离株在Vero细胞上增殖,细胞出现典型的病变;GXLC1株gE基因与GenBank上20株国内外具有代表性参考毒株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%,氨基酸同源性为94.3%~99.6%;gE基因的遗传进化分析显示,GXLC1株与2012年的国内流行毒株亲缘关系较近,与欧美分离株亲缘关系较远;氨基酸序列分析显示,GXLC1株gE蛋白主要抗原表位区较之国内经典强毒株有3个氨基酸位点的变异,可能导致gE抗原性发生改变。本研究将分离到的1个PRV毒株进行了gE基因的分析,发现GXLC1株为近年来流行的变异株,gE蛋白在抗原表位区上有3个氨基酸位点的变异,这是否会影响GXLC1株毒力和抗原性的变化,还有待进一步研究;对gE基因变异特征的分析和病毒的分离为进一步丰富广西PRV的分子流行病学和疫苗的研制提供参考依据和重要材料。     

伪狂犬病病毒FJMH1907b株的分离和gD基因的演化分析

为探究福建省新流行的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gD基因的遗传进化情况,根据GenBank已公布的PRV gD基因序列设计1对特异性扩增引物,对新分离PRV FJMH1907b株的gD基因进行PCR扩增、测序,与国内外已发表的15个毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树.新分离FJM...     

猪伪狂犬病病毒GZYY2015变异株的分离鉴定

本试验旨在从贵州省贵阳市云岩区某养猪场送检的经检测为猪伪狂犬病（PR）的样品中分离猪伪狂犬病病毒（PRV）。用细胞接毒试验、理化试验和透射电镜观察等方法分离、鉴定病原,测定病原的毒价后进行动物试验和gD、gE基因序列比对分析。结果显示,细胞接毒试验成功分离能致Vero细胞产生典型病变的PRV。理化试验表明,该分离毒株对5-碘脱氧尿核苷（idoxuridine,IUDR）和有机溶剂氯仿敏感,不耐酸和热。在透射电镜下可见近圆形、有囊膜、150~160 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体,有实心和空心2种形态;动物试验表明,该毒株对兔具有较强的致病性,可导致接种部位奇痒;核酸鉴定结果表明,扩增获得的PRV gD基因开放阅读框（ORF）为1 209 bp,gE基因ORF为1 740 bp。GenBank比对结果显示,gD基因与PRV JS 2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）核苷酸序列相似性均为99.8%,与疫苗株Bartha-K61（登录号：JF797217.1）相似性为98.7%;gE基因与PRV JS2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）和PRV Qihe547（登录号：KU056477）核苷酸序列相似性均为99.9%。基于gD、gE基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析发现,gD、gE基因与国内变异株均位于同一进化分支,对gE基因的遗传变异性分析结果表明,该分离毒株符合PRV变异株的变异模式。本试验结果表明,成功分离PRV变异株,可为贵州省PRV的流行病学遗传进化分析及免疫防控等提供参考。     

伪狂犬病病毒TJ-1株生物学特性研究

为了解天津地区伪狂犬病病毒TJ-1株的生物学特性,对该病毒进行了理化特性、免疫荧光、细胞培养特性和动物接种试验。结果表明,TJ-1毒株对乙醚、氯仿和胰蛋白酶均敏感;病毒在pH 5.0～8.0时比较稳定,在56℃下60min可被灭活;在PK-15、BHK-21和Marc-145细胞上均可生长,但呈现不同的细胞病变;在感染的PK-15细胞胞浆内可见绿色荧光;接种鸡胚绒毛尿囊膜可见白色的痘斑;人工感染家兔后,可引起家兔出现典型瘙痒症状并死亡。     

二乙烯亚胺对猪伪狂犬病病毒灭活效果研究

为研究二乙烯亚胺(BEI)对猪伪狂犬病病毒的灭活效果,使用终浓度为0.03%、0.04%和0.05%的BEI在30℃条件下对猪伪狂犬病病毒(DQ株)进行了灭活试验,通过ST传代细胞接种法观察病毒的灭活效果,用2~2.5 kg大耳白兔和断奶仔猪检测BEI灭活后的病毒液所制备疫苗的安全性,用小鼠检测该灭活工艺制备疫苗的免疫效果,并与传统甲醛灭活进行了比较。结果表明,终浓度为0.05%的BEI在30℃情况下经24 h即可彻底灭活PRV病毒;BEI灭活的病毒制备的疫苗接种大耳白兔和猪的安全性良好,免疫小鼠较甲醛灭活病毒能提供更高的保护率。本研究可为猪伪狂犬病灭活疫苗灭活工艺研究提供依据。     

伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

用核酸探针检测伪狂犬病的研究

用光敏生物素标记伪狂犬病毒（ＰＲＶ）特异性糖蛋白ＧＰ５０克隆重组质粒ＰＵＰ作为探针,检测实验感染乳猪１５头份以及屠宰场随机采样１５头份证明通过ＰＣＲ和分子克隆技术制备的ＰＲＶ特异性糖蛋白基因片段的光敏生物素探针,能有效地用于临床检测伪狂犬病。