无透明带体细胞核移植研究进展

目前,体细胞核移植主要还是沿用Willadsen发明的显微操作的去核、注核、融合和激活来完成。由于其核移植效率较低,且对仪器设备和技术人员的要求较高,因此,简化并建立一套更适合于生产条件下的体细胞核移植程序,从而提高核移植效率一直是人们所不懈努力的。作者就无透明带核移植技术和单个胚胎培养系统作一介绍。     

卵母细胞核因子促进核移植四倍体胚胎早期发育研究

研究旨在探讨猪卵母细胞核因子在重编程过程中发挥的作用。将体细胞引入未去核的MⅡ期卵母细胞中,构建体细胞核与卵母细胞核共存的核移植四倍体胚胎。通过分析核移植四倍体胚胎的早期发育情况探讨卵母细胞核因子对核移植四倍体胚胎早期发育的影响。结果显示,核移植四倍体胚胎、孤雌二倍体胚胎及孤雌单倍体胚胎这3组胚胎的卵裂率极显著高于核移植二倍体胚胎（P<0.01）,且核移植四倍体囊胚率及总细胞数也极显著高于核移植二倍体囊胚（P<0.01）。与通过标准核移植程序构建的核移植二倍体胚胎相比,核移植四倍体胚胎具有更强的发育能力。本研究建立了一个体细胞核与完整卵母细胞核因子物质共存的四倍体胚胎模型,有助于研究供体核与卵母细胞核之间的联系,为研究核因子在重编程过程中发挥的作用提供了平台。     

哺乳动物体细胞核移植方法研究进展

1997年克隆绵羊Dolly的诞生，揭开了哺乳动物体细胞核移植的序幕。多年来该技术已应用于多种哺乳动物，并成功获得体细胞克隆绵羊、小鼠、牛、山羊、猪、猫、免和骡等。同时，核移植技术本身也得到改进，从显微注射为主的传统方法逐步向手工操作方向发展，在克隆效率相当的情况下，后者实现了方法的简单化和生产力的提高，因而备受关注。当然这些新方法只是在个别物种中获得成功，其广泛应用还有待于进一步的研究和证实。     

BCB和Zebularine对绵羊体细胞核移植胚胎发育效果的影响

为探究亮甲酚蓝(BCB)染色选择的卵母细胞是否有利于体细胞核移植胚胎的体外发育,本实验将卵丘-卵母细胞复合体(COCs)放入含有BCB的PBS中染色,根据细胞质颜色可将卵母细胞分成BCB~+组和BCB~-组,并以未经BCB处理的COCs作为对照组,然后将卵母细胞进行体外成熟,统计卵母细胞的成熟率。将成熟后的卵母细胞进行体细胞核移植,其中,部分BCB~+组卵母细胞所需的供体细胞利用Zebularine处理,统计体细胞核移植的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率。结果表明:BCB~+组卵母细胞的成熟率显著高于对照组和BCB~-组(71.15%vs 65.38%,53.52%,P0.05);BCB~+组核移植胚胎的卵裂率(87.91%vs 56.83%)、桑椹胚率(37.41%vs 21.73%)和囊胚率(21.48%vs6.82%)均显著高于BCB~-组(P0.05);与对照组相比,BCB~+组卵裂率(87.91%vs 83.23%)和囊胚率(21.48%vs14.89%)也显著升高(P0.05)。BCB~+组供体细胞经Zebularine处理后,胚胎发育能力进一步提高,其中囊胚率显著高于BCB~+组、对照组和BCB~-组(29.25%vs 21.48%,14.89%,6.82%,P0.05)。     

鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法，将小鼠宰杀在20℃下搁置14h，然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子，与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示，与带有颗粒细胞卵的体外受精率（0％） 透明带切开卵的体外受精率（4％－31％）相比，去透明带卵的体外受精率增至39％－68％（P＜0．01）；体外受精所 2细胞胚，经培养有74％－100％的胚胎发育至扩经囊胚；来自BDF1雄性小鼠精子的2细胞期体外受精胚，经体外培养至囊胚期后再移植，获得了正常新生小鼠，以上结果表明，去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精，可提高小鼠弱精子的利用率。     

猪胚胎细胞核移植研究进展

细胞核移植是目前倍受学术界和国际社会关注的焦点问题之一。已经获得牛、羊、猪、兔、鼠等核移植个体,而且成功地得到体细胞核移植绵羊和小鼠。尽管猪胚胎细胞核移植也有报道,但进展缓慢,现对猪细胞核移植的研究现状,以及与之有关的卵母细胞孤雌激活等问题作较系统的综述。     

猪手工体细胞核移植电融合/激活参数的优化

通过对猪体细胞核移植中电融合及联合化学激活对猪重构胚发育能力进行探讨,为广西巴马小型猪的手工克隆搭建平台.利用手工克隆(HMC)技术对猪体细胞核移植胚胎采用不同的电融合方法和融合后化学激活不同时间,研究猪手工克隆胚胎的发育能力.结果表明:(1)对重构胚进行一步法电融合时,参数2(180 V·mm-1,30μs×1次)与参数1(160·mm-1,30 μs×1次)两组间的融合率差异显著(65.31%VS 58.33%,P<0.05);(2)对重构胚进行两步法融合时,参数3(第一次:180 V·mm-1,10μs×1次,融合60 min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80 μs×1次)和参数4(第一次:200 V·mm-1,10μs×1次,融合60 min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80μs×1次)两组间的总融合率差异不显著(75.88%vs 81.20%,P>0.05);(3)采用参数4与采用参数2融合的重构胚其分裂率和囊胚率均差异不显著((79.98%vs 72.66%)和(13.14%vs 9.36%),P>0.05);(4)在电激活和CHX+CB联合激活4、5、6 h这3组中.其分裂率和囊胚率均差异不显著(P>0.05).相对而言,重构胚采用参数4的两步融合法和CHX+CB激活5 h效果较好.     

西洛酰胺对绵羊卵母细胞核成熟及后期胚胎发育的影响

本实验研究不同浓度西洛酰胺(Cilostamide)对绵羊卵母细胞核成熟的抑制效果,并探讨FSH对Cilostamide抑制效果的影响,以及延迟卵母细胞核成熟对随后胚胎发育能力的影响,旨在探索提高绵羊体外胚胎发育能力的新方法。结果表明:5μmol/L的Cilostamide为较合适的添加浓度,使卵母细胞核成熟延迟约4 h;FSH与Cilostamide对抑制核成熟起到协同作用;5μmol/L Cilostamide处理可使绵羊卵母细胞孤雌激活后囊胚率达到40.4%,显著高于对照组29.0%的囊胚率(P<0.05)。     

卵母细胞体外成熟与体细胞核移植

众所周知,体细胞核移植中体细胞必须在去核的卵母细胞内进行重编程,以恢复其全能性,而卵母细胞的成熟程度则会直接影响体细胞的重编程过程。所以卵母细胞的体外成熟,作为体细胞核移植过程中的一个关键环节而为人们所关注。哺乳动物在胎儿出生前后就形成了一定数量的卵母细胞,在胎儿时期,卵巢内有相当数量的由原生殖细胞形成的卵原细胞,卵原细胞进一步形成初级卵母细胞(此期又称为GV期),此时卵母细胞生长极不明显可持续几个月到几十年。性成熟后,卵母细胞进入迅速生长阶段,形成大量卵黄,积累各种营养物质,完成了卵质的分化,合成储存了胚胎早…     

猪细胞核移植中卵母细胞激活方法的研究进展

猪的克隆 (核移植 )是当今的热点研究之一 ,研究意义重大。本文就猪核移植中卵母细胞的激活方法、原理及相关研究等作一综述。     

哺乳动物体细胞克隆技术的应用前景

体细胞克隆的成功为农业、医学以及生物学基础研究提供了新的工具。体细胞核移植技术和转基因、胚胎干细胞等现代生物技术的相互渗透更是活跃。当前,尽管体细胞核移植效率仍然不甚理想,而且克隆后代成活率低、畸形率高,但人们还是对该技术的发展充满了憧憬,尤其希望借助这一手段在攻克一些长期困扰人类的疑难疾病上有所突破。作者则总结了体细胞核移植在上述各方面的应用价值,供同行参考。     

小鼠体细胞核移植研究进展

体细胞核移植是目前生物技术领域研究的热点之一。小鼠作为一种广泛使用的实验动物模型,具有遗传背景清楚、繁殖周期短、饲养成本较低等优点,因此小鼠体细胞核移植具有较大的研究价值。作者简要回顾了小鼠体细胞核移植的发展史,并对体细胞核移植方法、影响核移植效率的因素,包括供核细胞的类型、供核细胞的体外处理、核质细胞周期协调、重构胚的激活、体外培养体系及核移植分子机制等进行了综述,并展望了小鼠体细胞核移植的应用前景。     

供体细胞对哺乳动物体细胞核移植的影响

哺乳动物体细胞核移植技术(克隆)在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法.文章依据近年来国内外在动物克隆技术方面的资料,分析了供体细胞类型、供体细胞动物年龄、供体细胞所处细胞周期、体外传代次数以及供体动物性别等因素对克隆动物效率的影响及可能原因.     

体细胞核移植技术在转基因动物研究中的应用

利用基因工程技术将目的基因整合入动物体细胞染色体中，并将其作为供体核移植入受体－－去核卵母细胞构成重建胚，然后将其移植入假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到经定向遗传修饰的转基因克隆动物。本文就这一领域的发展历史、研究现状、应用前景及存在的问题等方面作一概述。     

牛体细胞核移植技术

对牛体细胞核移植技术中核供体细胞周期同期化处理，电融合条件及去核方法等进行了研究。结果表明，血清－饥饿组（细胞周期同期化处理组）的移核重构胚细胞融合率（83．3％），卵裂率（70％）和囊胚发育率（33．8％）与血清－选择组对应指标间无显著性差异（82．3％，69．2％，32．4％，P＞0．05）；但上述2组分别极显著高于血清－随机组（64．8％，33．8％，4．35％，P＜0．01），试验确立了场强1.025kV/cm，脉冲宽度50μs，连续2次脉冲为最佳电融合条件。摸索出的点击去核法，对卵母细胞进行去核，去核成功率达90％，极显著高地吸引法的68．3％（P＜0．01）；其囊胚发育率为34．1％，显著高于吸引法的18．0％（P＜0．05），与挤压法（20．9％）相比差异不显著（P＞0．05），移植重构胚胎移植后，产2头成活的体细胞克隆牛。     

DNA甲基转移酶抑制剂在动物体细胞核移植研究中的应用

甲基化对胚胎发育和机体形成具有重要的调控作用,体细胞核移植胚胎常常表现出异常的DNA甲基化,DNA甲基转移酶抑制剂能抑制细胞的DNA甲基化水平,从而达到提高体细胞核移植效率的作用。作者主要综述了DNA甲基转移酶抑制剂在动物体细胞核移植研究中的应用。     

体细胞核移植生产梅山猪

本研究以中国优良地方品种梅山猪为材料,采用胰酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,通过使用Y染色体SRY基因引物SRY-1、SRY-2进行PCR扩增,结果发现,雄性胎儿样本能扩增出250 bp的Y染色体特异性基因片段,而雌性胎儿样本未扩增出此条带;G1、G2、G3、G4和G5代的融合效率差异不显著(P>0.05),但G5代作为供体细胞核移植的重组胚胎卵裂率显著高于G1、G2、G3和G4代(P<0.05);使用G5代的胎儿成纤维细胞作为供核细胞,通过手术移植的方法,将重构胚胎移植到二元后备母猪体内,结果成功地获得了体细胞克隆梅山仔猪,并且仔猪全部为雄性胎儿,说明该性别鉴定方法不但操作简单,而且准确度高;经微卫星DNA 多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系。本研究将为中国优质猪品种改良、保种、性别控制及建立人类疾病模型等研究提供有效可行的方法,为批量生产克隆优秀种猪提供了坚实的理论基础。     

哺乳动物体细胞核移植胚胎发育中表观重编程的研究进展

体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）是一种能将已分化的体细胞重编程为全能胚胎的繁殖生物技术,在良种扩繁、濒危物种保护和治疗性克隆等方面有着广泛的应用前景,但极低的克隆效率、克隆动物胎盘异常、出生后胎儿畸形等严重限制了该技术的实际应用。造成克隆效率低和胚胎发育异常的主要原因是供体核表观遗传重编程错误或不完全。1958年,将非洲爪蟾（Xenopus laevis）幼体肠细胞核移入去核卵母细胞,获得了第1例SCNT动物个体;1986年,通过电融合1个卵裂球与去核卵母细胞成功获得了3只存活的羔羊;1997年,将成年母羊的乳腺上皮细胞与去核卵细胞电融合,获得首个SCNT哺乳动物"多利",开启了克隆时代,目前牛、小鼠、山羊、猪、欧洲盘羊、家兔、家猫、马、大鼠、骡子、狗、雪貂、狼、水牛、红鹿、单峰骆驼、食蟹猴等相继成功克隆,其中最引人瞩目的是2018年食蟹猴的成功克隆。作者通过将SCNT胚胎与受精胚胎的发育进行对比,阐述了SCNT过程中DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、染色体状态等的重编程过程和缺陷,并从表观修饰剂、组蛋白去甲基化酶、抑制Xist表达、补充鱼精蛋白和精子RNA方面探讨单独或联合消除表观遗传重编程障碍对克隆效率的影响。随着低样本量测序技术的发展和完善,人们能够在SCNT胚胎中检测到更详细的全基因组表观遗传修饰图谱,进一步揭示SCNT胚胎表观遗传重编程中的缺陷,为提高克隆效率提供了线索。通过上述内容的阐述,希望为后续开发联合消除多种表观遗传障碍而提高克隆效率的策略和思路。     

延边黄牛体细胞核移植的研究进展

牛体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一套极其复杂的技术体系,它包括卵母细胞的成熟、供核细胞的准备、卵母细胞的显微操作、细胞融合、卵母细胞激活和胚胎培养。因此,许多因素影响着核移植胚胎发育。虽然陆续有克隆牛出生的报道,但是克隆效率依然低下。本综述对延边黄牛体细胞核移植体系的6个方面进行简单综述,以期为探究延边黄牛体细胞克隆的最优化条件、建立最优化的培养体系、提高克隆效率提供参考。     

Research Advances on Somatic Cell Nuclear Transfer in Yanbian Yellow Cattle

Bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a sophisticated technique system,including oocyte maturation,donor cell preparation and oocytes microscopic operation,fusion,activation and culture.Although the birth of cloning cattle has been reported recently,the efficiency of somatic cell cloning has remained lowly.In order to establish the optimization somatic cell nuclear transfer system of Yanbian Yellow cattle,this review summarized only from 6 main aspects mentioned above in this field.