叶片保存方法对RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒的影响

【目的】探究通过RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒最好的叶片保存方法。【方法】经自然风干法、硅胶干燥法以及氧化钙干燥法保存后,采用RNA小量提取试剂盒法提取被病毒侵染草莓叶片总RNA,利用Thermo NanoDrop 2000测定核酸质量浓度和质量并使用RT-PCR方法对SMYEV进行检测。【结果】经氧化钙干燥保存后可提取高质量的RNA,30 d后仍可通过RT-PCR获得扩增产物。【结论】氧化钙干燥保存效果最好,操作简单,成本低,可广泛应用于大量草莓叶片样本的长距离运输,提高草莓病毒检测效率,为草莓无毒栽培提供保障。     

利用内标为基础的多重RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

草莓斑驳病毒(SMoV)和草莓轻型黄边病毒(SMYEV)分布较广,危害较重。应用CTAB法提取草莓总RNA,以优质的草莓总RNA为模板,结合扩增内标的检测体系,建立了SMoV和SMYEV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株和试管苗进行快速稳定的病毒检测。     

叶片不同保存方法对杨树基因组DNA提取效果的影响

以杨树叶片为试验材料,采用改良SDS法提取基因组DNA,分析5种不同保存方法对样品提取效果的影响.通过A260 /A280、琼脂糖凝胶电泳、ISSR-PCR扩增分析对提取的基因组DNA进行鉴定,结果表明,低温保存杨树叶片是比较理想的方法,而在远距离野外资源调查收集时,采用硅胶干燥保存样品是比较可行的.     

甘薯羽状斑驳病毒RT-PCR检测

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列设计并合成特异性引物,建立SPFMV的RT-PCR检测程序。特异性和重复性实验结果表明,该方法能够检测SPFMV,具有很好的特异性和重复性。并对PCR产物进行测序鉴定,结果与报道的序列同源性为88.3%和98.6%,证实所扩增的片段是病毒基因的部分片段。     

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)

[目的]通过对反应条件和参数的摸索与优化,建立多重RT-PCR检测方法,实现2种病毒的同时高效快速检测。[方法]通过CTAB法与试剂盒提取RNA,以优质的总RNA为模板,进行梯度PCR,结合扩增内标的检测体系,建立多重RT-PCR检测方法。[结果]建立了优化的SCV和SVBV的多重RT-PCR检测体系,可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。[结论]该研究为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法,为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。     

利用玻璃化超低温技术脱除草莓斑驳病毒(SMoV)的初步研究

以携带草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的‘红颜’草莓为材料,通过对玻璃化超低温脱毒技术中各程序的优化,建立适合‘红颜’草莓的茎尖玻璃化超低温脱毒体系。结果表明:1~2mm的茎尖在0.5mol/L蔗糖的预培养基预培养3~7d,室温装载处理60min,0℃玻璃化处理180min,液氮冷冻60min,40℃解冻2min,高糖溶液卸载20min后接种到MS+2.0mg/L 6-BA再生培养基上,成活率可达70%以上。再生培养60d后,随机选取20株再生植株,利用RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒的脱毒效果,脱毒率为100%。利用该体系可以克服传统茎尖脱毒受茎尖大小的限制(0.1~0.3mm),并有效脱除草莓斑驳病毒。     

不同保存方法和研磨方式对玉米总DNA提取效果的影响

以玉米自交系昌7-2为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,分析不同保存和研磨方法等对样品提取效果的影响。通过A260/A280、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增,对提取的基因组DNA进行分析鉴定。结果表明,CTAB缓冲液保存叶片并在CTAB缓冲液中研磨叶片,得到的DNA效果最佳,同时这种方法也比较经济安全。     

草莓斑驳病毒的分子杂交检测

为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。     

三种草莓病毒的多重RT-PCR检测方法

目前,草莓主要有3种病毒侵染,本研究通过改进CTAB法对经过茎尖剥离的组培四季草莓叶片提取总核酸,采用多重RT-PCR技术同时检测草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒。电泳结果显示提取的总核酸中可见总DNA条带和完整的RNA条带,并采用两步法RT-PCR获得了目的条带。本研究建立了多重RT-PCR同时检测草莓病毒的技术体系。     

草莓病毒的检测——小叶嫁接法

草莓是多年生草本植物,生产上为无性繁殖,经多年栽培后,很容易感染多种病毒,致使种性严重退化,产量降低,品质变劣,抗病性减弱等.一般减产30%～80%,并逐年加重,给草莓生产带来重大损失.目前,还没有可以有效防治的药剂,惟一的出路就是脱去植株中的病毒.但是,草莓经脱毒处理后需要经过检测、验证确实不带有病毒后,才能定为无病毒原种母株,然后以此繁育无病毒苗,实现草莓的脱毒化栽培.     

草莓不同叶位叶片光合特性研究

以草莓品种"达赛莱克特"为对象,研究了草莓叶片的光合特性,以期为草莓生产提供光合理论依据。结果表明:草莓光合特性与叶位叶龄有关。不同叶位叶片的光合速率(Pn)依次是上位叶<下位叶<中位叶。饱和光强是上位叶<下位叶<中位叶,补偿点也是上位叶<下位叶<中位叶。CO2补偿点是中位叶<下位叶<上位叶,饱和点是下位叶<上位叶<中位叶。     

草莓6种病毒多重PCR快速检测方法的建立

为快速鉴定草莓病毒病种类以预防病毒病扩散,根据草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)、草莓白化病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)、草莓病毒1(strawberry virus 1,StrV-1)和芸薹黄化病毒(brassica yellows virus,BrYV)的基因保守区域设计特异性引物,建立了能够同时检测这6种病毒的多重PCR方法。该多重PCR反应体系中,2×SanTaq PCR Master Mix用量为10 μL,上下游引物(10 μmol/L)用量为4 μL,其中SVBV为0.25 μL、SMoV为0.50 μL、SMYEV为0.10 μL、SPaV为0.15 μL、StrV-1为0.50 μL和BrYV为0.50 μL,模板1 μL,ddH₂O为5 μL,总体积20 μL。多重PCR反应程序设定为:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸120 s,最后72 ℃延伸10 min,循环数为35。该检测体系的灵敏度可以达到10⁷ copies/μL。该多重PCR方法可以同时实现6种草莓病毒的高效快速检测,为草莓病毒病的早期发现和针对性防治提供了技术支持。     

利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

不同光强下DA-6对草莓光合作用及抗氧化酶活性的影响

为了弄清DA-6对不同光强下草莓光合作用提高的效果,以‘甜查理’草莓为试材,通过遮荫处理,研究了100％、70％和50％自然光条件下喷施20mg／LDA-6处理对草莓叶片气体交换参数、光合酶活性及抗氧化酶活性的影响。结果表明：遮荫条件下,草莓叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、核酮糖-1,5-二磷酸加氧／羧化酶（Rubisco）、果糖-1,6二磷酸酯酶（FDPase）活性均明显降低,而胞间C0z浓度（Ci）升高。表明遮荫条件下,草莓叶片光合速率下降的主要原因是非气孔限制,而且与光合相关酶类活性下降密切相关。DA-6处理可以不同程度提高各光强条件下草莓叶片的Pn、Gs、Tr及Rubisco、FDPase的活性,同时降低超氧阴离子（0f）产生速率,提高SOD、CAT和APX等保护酶的活性,从而提草莓叶片的光合作用。在相对较弱的光强条件下（50％自然光）,DA-6的作用更为显著。     

RT-PCR法特异性快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒运动蛋白基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,建立该病毒的快速检测方法。该方法可以从带毒叶片中扩增到约591 bp的片段,而TMV属其他9种病毒均无特异性扩增。本方法也适用于带毒种子的检测,具有准确、灵敏及时效性强等特点,为进出境植物检疫和农业安全生产提供可靠的技术支持。     

RT-PCR技术检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)

根据猪PRRSV的ORF7基因序列,设计并合成了1对引物,以PRRSV RNA为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PRRSV的RT-PCR方法。应用该方法对病毒细胞培养物进行基因扩增,均获得了分子量为443bp的特异性目的片段,而对PCV2、PRV、CSFV及Marc-145细胞进行同条件检测,结果均为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与文献报道的PRRSV其他毒株序列同源性达92%~98%。敏感性试验表明,该体系可检测到2.39TCID50的PRRSV;对2004~2005年送检的81份临床样品进行检测,阳性率为23.4%。上述研究结果表明,建立的RT-PCR特异性好、敏感性高,可用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和流行病学调查。     

不同样品对黄羽种鸡禽白血病病毒净化检测效果的影响

【目的】评估黄羽种鸡禽白血病的净化工作,比较源于同一鸡群不同样品对禽白血病病毒(ALV)检测结果的影响.【方法】采用ALV抗原ELISA方法对广东一黄羽种鸡场采集的2 691枚种蛋进行检测,根据检测结果采集其中70份不同S/P区间所对应的母鸡抗凝血,分离血浆后分别同时接种于CEF和DF-1细胞,用病毒分离方法进行检测,并用PCR方法进行亚群鉴定.【结果和结论】从送检种蛋蛋清共检出ALV p27阳性样品243份,阳性率为9.03%(243/2 691);蛋清不同ELISA S/P区间所对应的病毒分离情况分别为:蛋清ELISA S/P≥2.0的鸡只其血样CEF和DF-1细胞病毒分离率均为100%;1.5≤S/P2.0的鸡只病毒分离率均为88.9%;1.0≤S/P1.5的鸡只病毒分离率均为85.7%;0.2≤S/P1.0的鸡只病毒分离率分别为60%~75%(CEF)和40%~50%(DF-1);0.1≤S/P0.2的鸡只病毒分离率为62.5%(CEF)和50%(DF-1);S/P0.1的鸡只分别为27.2%(CEF)和9.1%(DF-1)的病毒分离率.PCR结果显示,所有7份CEF+DF-1-的CEF培养物中有6份为内源性ALV-E.研究表明,在蛋清ELISA检测时,S/P越高的阳性蛋清样品其对应母鸡越可能是外源性ALV病毒血症阳性;有一定比例S/P较低的阳性蛋清样品是由对应母鸡体内的内源性ALV排毒所致;而净化初期少数蛋清S/P为阴性的蛋清,其对应母鸡仍可能检出外源性ALV,说明在黄羽种鸡外源性ALV净化方案中单独使用1次蛋清ELISA检测可能会给禽白血病的净化检测造成一定的"误诊"和"漏检".     

自然休眠期低温处理时间对生长期草莓叶片光合特性的影响

以草莓为料材,研究自然休眠期不同低温处理时间对其生长期叶片光合特性的影响.结果表明:在自然休眠过程中,随着低温处理时间延长,草莓新生叶叶面积、叶柄长度不断增加,而初生叶柄角度不断变小,完全通过休眠后,不再有显著变化.新生叶片的光合速率、气孔导度、叶绿素质量比和光合作用关键酶活性也随着低温处理时间延长而不断升高,当低温处理时间大于765 h后,不再有显著变化.自然休眠过程中,低温处理时间可通过调节气孔因素、叶绿素质量比和光合作用关键酶活性来调控生长期草莓叶片的光合作用,当完全通过休眠后,低温处理时间对草莓的生长发育和叶片的光合特性不再有显著影响.