布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测.     

人参实时荧光定量PCR鉴定方法的建立

根据人参和人参属其他物种的18S rRNA基因序列差异设计特异引物和探针,建立人参TaqMan实时荧光PCR鉴定方法.应用该方法测试58个样品,包括30个不同来源的人参样品、 15个其他人参属样品以及13个形态近似样品.结果表明：所有供试的人参样品均表现为阳性扩增,非人参及空白对照均未出现阳性扩增.灵敏度检测结果显示：此实时荧光PCR方法的最低检测限为0.03 pg/μL反应.此方法可快速、准确、灵敏地鉴定人参及其加工产品,适用于口岸进出口鉴定.     

实时荧光定量PCR定量方法研究进展

实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究进展,并展望了其应用前景。     

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法,合成目前报道最多的布鲁氏菌IS711插入序列、per基因和bcsp31基因的引物和探针,并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示：3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应;3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时,3种方法的敏感性均高于套式PCR方法,其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%,其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言,IS711荧光定量PCR敏感性最高,更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。     

实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合症病毒方法的建立

[目的]根据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）的保守序列,利用Primer5.0软件设计引物,建立了WSSV的荧光实时定量PCR检测体系。[方法]构建含有WSSV目扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,探索反应条件。[结果]确定了最佳退火温度（61℃）和最佳引物浓度（0.2μmol/L）,标准品浓度在8.8×1098.8×104个拷贝数之间有典型的＂s＂型扩增曲线,标准曲线中模板拷贝数（X）与Ct值的关系为Ct=-3.597lgX＋42.547,相关系数R2=0.993。[结论]该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）没有扩增反应。     

绵羊肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

为研究绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）侵害山羊的组织嗜性、筛选其最佳培养基及建立快速检测方法,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,以Mo Y98株16S rRNA基因重组质粒pMD19 MoFQ为模板,通过优化反应体系构建标准曲线,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因的FQ PCR方法,并对所建方法进行重复性、特异性、敏感性及应用性检测。结果表明,所建Mo 16S rRNA基因检测FQ PCR方法具有较好的重复性、特异性、临床应用性,Mo核酸拷贝最低检出量可至10 μL^-1。该方法不仅可作为Mo临床检测方法,且为后续Mo研究工作提供技术支持。     

山羊痘病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊痘病毒(AY077835)gp063基因DNA序列,应用Beacon Designer 7.0软件,设计合成1对引物和1条TaqMan探针,同时制备含有靶DNA序列的pEASY-T1重组质粒标准品。通过引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了山羊痘病毒TaqMan法实时荧光定量PCR。该方法组内和组间重复试验变异系数均低于2%,最低浓度检测极限值为1×100copies/μL,上机检测时间少于40 min。运用该方法对不同时期流行于云南局部的山羊痘临床组织病料进行定量检测,生成的标准曲线斜率(Slope)为-3.36,截距(Intercept)为41.08,相关系数(R2)为0.999 989,阳性对照及送检样品抽提DNA中病毒含量依次为:P(TK)2.70×105copies/μL,华坪(HP)毒株1.45×106copies/μL,景谷(JG)毒株5.12×105copies/μL,保山(BS)毒株2.96×105copies/μL,宣威(XW)毒株1.86×105copies/μL,永胜(YS)毒株1.36×103copies/μL。结果表明:所建立方法具有灵敏、特异、安全、快速的特点,适合于山羊痘的早期检测。     

实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgM mRNA方法的建立

建立了SYBR greenⅡ实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgMmRNA水平的方法,即构建鲫鱼IgM标准品质粒,10倍稀释质粒标准品,建立标准曲线,进行熔解曲线分析和稳定性分析。结果表明,Ct值线性范围为5.8～25.4,相关系数为1;熔解曲线峰值单一,Tm为85.62(±0.13)℃;组内变异系数CV为0.18%～1.07%,组间变异系数为0.31%～2.31%。该方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

异硫氰酸胍法提取梅花鹿鹿茸组织总RNA

采集6只2岁梅花鹿鹿茸样品,应用异硫氰酸胍法提取其总RNA,建立了鹿茸总RNA适宜提取条件。实验最终提取RNA的紫外吸收值为:A260/A280=1.73~1.86,A260/A230=2.16~2.53,经甲醛变性凝胶电泳可以清晰看到28s、18s、5s 3条带,其亮度满足未降解RNA的特征,且无明显DNA污染。     

鹿茸提取物对糖尿病小鼠血糖及衰老的影响

为了研究鹿茸提取物对四氧嘧啶(ALX)诱导糖尿病小鼠的降糖和抗衰老作用,利用ALX建立了糖尿病小鼠模型,并将鹿茸提取物(RD)分为低(1.6mg/g)、中(3.2mg/g)、高(4.8 mg/g)3个剂量组,对建模成功小鼠连续灌胃4周.试验结果与模型对照组相比,鹿茸提取物能极显著地降低ALX糖尿病小鼠血糖水平、丙二醛(MDA)浓度,提高肝(肌)糖元质量分数以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、麦芽糖酶(CAT)的活性,增强机体抗氧化能力.鹿茸提取物能有效地控制糖尿病小鼠血糖水平,提高机体抗衰老能力.     

梅花鹿三种茸片和鹿角盘性激素含量测定权

本试验对梅花鹿的鹿茸腊片、鹿茸粉片、鹿茸血片和鹿角盘分别进行了孕酮、睾酮和雌二醇的检测。结果表明,鹿角盘中3种激素均含有,含量基本均衡;3种鹿茸片均未检出雌二醇;各组孕酮含量均高于睾酮含量;孕酮含量各组差异显著（P〈0．05）,睾酮含量各组差异不显著（P〉0．05）;鹿茸腊片中孕酮和睾酮含量均为最高;以上检测结果为鹿茸的食用和医用及鹿产品开发提供理论基础。     

马鹿茸、梅花鹿茸不同部位无机元素含量测定分析

目的 测定分析中国新疆塔里木马鹿茸、东北马鹿茸和东北梅花鹿茸不同部位中无机元素含量。方法 采用原子吸收光谱法和电感耦合等离子体发射光谱法。结果 从所测鹿茸各部位均检测出26种无机元素。其中包括5种人体必需的常量元素Ca、P、Na、Mg、K和11种人体必需的微量元素Fe、Cr、Cu、Sr、Ni、Zn、Mo、Co、Mn、V、Sn。结论 各鹿茸不同部位的无机元素种类相同,同一元素在同一鹿茸不同部位的含量有一定差异;同一元素在不同鹿茸相同部位中的含量也有差异。     

以鹿茸为模型探索软骨组织发生

软骨组织的研究一直依赖于哺乳动物胚胎模型,这种方法存在取材困难、难以明确界定分层边界等弊端。而鹿茸非常独特,可以作为一种新的生物医学模型对软骨发育进行研究。通过比较传统的软骨研究模型和鹿茸这种新型模型,分析了鹿茸作为软骨研究模型的优势,同时对鹿茸软骨组织发生与生长的组织基础,以及分子调控机制的研究进展进行了综述,并对鹿茸软骨组织中血管生成的调控因子进行了探讨,以期为寻找更有效的软骨发育研究模型提供理论参考。     

梅花鹿鹿茸有害元素、农药残留及微生物分析初报

对吉林省3个国营养鹿场的鹿茸样品－－三杈茸和二杠茸各3支，分别进行了有害元素，农药残留及微生物的分析。结果表明：三杈茸与二杠茸，砷含量分别为0.30mg/kg，0.23mg/kg，铅含量分别为0.37μg/g，0．48μg/g；汞含量分别为0．06μg/g，0．04μg/g；六六六含量分别为0．020μg/g，0．0088μg/g，DDT均小于0．00005μg/g；微生物细菌总数，霉菌，致病菌均未检出，2种茸大肠菌群均小于30MPN／100g。     

鹿茸·鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响

[目的]研究鹿茸、鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响,为鹿蛋白质药理作用研究提供科学依据。[方法]提取鹿茸、鹿花盘蛋白,给小鼠灌胃,研究其对小鼠体重、胰腺系数、肾脏系数的影响。[结果]驯鹿茸蛋白提取物可增加小鼠体重,梅花鹿茸、鹿花盘蛋白对小鼠体重有抑制作用;3种蛋白提取物对小鼠胰腺、肾脏系数无影响。[结论]3种蛋白对小鼠体重有调节作用;3种蛋白对小鼠无明显毒性作用。     

鹿茸多肽的生物学活性研究

采用醇沉法从新鲜马鹿茸中提取出活性多肽。该多肽为一系列分子量低于17 kD的多肽混合物,Western blotting检测到其含有胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。Bradford法定量总多肽约为1~2 mg/g鲜重,RIA法定量IGF-1为300~400 pg/g鲜重。小鼠腹腔连续注射多肽6 d后,对其促生长、免疫调节、抗氧化、抗疲劳等生物学活性进行了研究。结果表明:小鼠体重较对照组有增加趋势(P>0.05);腹腔注射1,4,8 mg/kg鹿茸多肽组小鼠玫瑰花环成环率分别高于对照组(生理盐水)33.3%,34.2%,39.6%,差异显著(P<0.05)。注射8 mg/kg鹿茸多肽的小鼠血清溶血素OD值与对照组差异极显著(P<0.01)。实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率分别比对照组高22.1%,25.8%,26.5%,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01),说明鹿茸多肽具有免疫调节作用,且呈剂量依赖性。注射4,8 mg/kg鹿茸多肽组老年小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性分别升高51.1%,59.2%,血清丙二醛(MDA)含量分别下降14.9%,16.7%,与对照组差异显著(P<0.05),说明鹿茸多肽对老年小鼠有较强的抗氧化作用。小鼠负重游泳实验中,注射小鼠存活时间比对照组延长了21.67 min(P<0.05),说明鹿茸多肽具有抗疲劳作用。     

马鹿茸性激素样作用的研究

目的研究马鹿茸是否有性激素样作用。方法以大、小白鼠用药前、后前列腺精囊重量法探讨马鹿茸雄激素样作用;用小白鼠阴道涂片法和蟾蜍排精及雌家兔妊娠试验,探讨马鹿茸雌激素样作用。结果雄性大白鼠和小白鼠用马鹿茸细粉灌胃,其前列腺和精囊腺重量均显著高于对照组。雌性小白鼠用马鹿茸粉灌胃后,其阴道涂片角化细胞和上皮细胞显著增多,表现出明显的性周期;蟾蜍胸淋巴囊注射马鹿茸提取物后排精明显增加,灌胃马鹿茸细粉的雌家兔卵巢明显肥厚,且卵巢出现血斑数随马鹿茸剂量增加而增多。结论本试验表明马鹿茸有性激素样作用。     

鹿茸提取物与黑木耳多糖协同作用对糖尿病小鼠血糖血脂的影响

为了研究鹿茸提取物与黑木耳多糖复配对四氧嘧啶(ALX)诱导糖尿病小鼠的降糖和降血脂作用,用ALX成功地制造了糖尿病小鼠模型,把鹿茸提取物和黑木耳多糖按一定比例复配后分为低、中、高3个剂量组,对建模成功小鼠,每天一次性灌胃,连续灌胃4周。试验结果与模型对照组相比,各剂量组能极显著地降低ALX糖尿病小鼠血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,同时可调节糖尿病小鼠的饮食水平。结果表明鹿茸提取物与黑木耳多糖复配能有效地控制糖尿病小鼠的血糖血脂水平,纠正其脂质代谢紊乱。