伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病毒gD基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病毒的PeR引物和一条Taqman荧光探针,采用LightCycle 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1．0×10^1-1．0×10^10拷贝,灵敏度可达2拷贝,比常规PCR高100倍。该方法检测时间短,速度快,仪器的运行时间仅为1h,特异性明显高于常规PCR。对15株猪伪狂犬病毒进行了检测,结果均为阳性;与猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养和常规PeR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好的优点,可望用于,临床上伪狂犬病的检测和病毒分布的研究等。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

检测伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR方法的建立

利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒（PRV）各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种快速检测伪狂犬病病毒的荧光定量PCR技术。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对制备的pMD-gB阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/反应;同时相比于普通PCR方法其灵敏度高100～1 000倍以上,并且重复性好。在对60份临床样品的检测中,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的优化

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种疱疹病毒性疾病,在世界大部分地区都是地方性家畜流行病。而且猪伪狂犬病与其他猪传染病不易区分,因此,建立一个特异性强的检测方法对于其诊断具有重要意义。实验是在实验室已经建立伪狂犬病毒单项PCR检测方法的基础上,对扩增条件进行优化后对其特异性进行了验证。结果发现,优化后的方法特异性好,只有猪伪狂犬病毒扩增为阳性,其余DNA病毒:猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)均呈现阴性。因此,本研究方法可以为今后实验室检测猪伪狂犬病毒提供参考。     

猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

当前猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒（并作为阳性质粒）,针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR检测下限为4.545×102拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2（圆环病毒2型）、PPV（细小病毒）、PRRSV（蓝耳病病毒）、PEDV（流行性腹泻病毒）和TGEV（传染性胃肠炎病毒）等不产生交叉反应。此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率（13.33%,2/15）。因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),设计并合成1对引物.通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.999 9,最低检测的拷贝教为35.4拷贝/25 μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点.本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.     

猪伪狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因的序列（EF552427）,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9999,最低检测的拷贝数为35.4拷贝/25μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点。本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒纳米PCR检测方法的建立

[目的 ]快速灵敏检测猪伪狂犬病毒(PRV)[方法 ]根据PRV g B基因设计特异性引物,建立了PRV纳米PCR检测方法。[结果 ]PRV纳米PCR方法的最低检出限为10拷贝/μL,其敏感性比未添加纳米金的对照PCR提高100倍;建立的纳米PCR与猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等常见猪病毒性病原均无交叉反应。应用纳米PCR和PRV国家标准中的PCR方法,对2014—2016年期间采集自17个省市发病猪场的148份临床样品进行平行检测,PRV纳米PCR的阳性检出率为49.3%(73/148),PRV国标PCR方法的阳性检出率为23.6%(35/148),并且PRV纳米PCR检测为阳性,而PRV国标PCR方法检测为阴性的38份样品,测序结果均确认为PRV阳性。[结论 ]本研究建立的纳米PCR检测方法敏感特异,可用于猪伪狂犬病的病原学检测。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法.实验结果表明,当50 pmol/L的引物O.3μL和5 pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍.该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.     

应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Ⅱ型猪圆环病毒

Ⅱ型猪圆环病毒（porcine circovirus type2，PCV-2）为近年来引起多种综合征的重要病原，且经常与猪呼吸与繁殖障碍综合症、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒发生混合感染。建立对于该病毒的快速检测及准确定量的方法，无疑对于病原诊断及病因学研究具有重要的意义。实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。     

实时荧光定量PCR法检测转基因猪外源基因整合拷贝数

以GFP转基因猪为研究对象,以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数。同时,利用Southern-blot进行验证分析。结果显示:实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern-blot检测一致。结果表明:实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用

根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究针对猪伪狂犬病病毒的gE基因序列进行分析比较,设计了一条TaqMan-MGB探针,建立了区别野毒株及基因缺失疫苗株的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法检测猪伪狂犬病病毒特异性强,能很好的区分猪伪狂犬病病毒与其它病毒。用该方法对83份疑似样本进行检测,与常规PCR检测法符合率达到100%,表明该方法用于检测猪伪狂犬病病毒具有良好的实用性。     

PCR技术检测猪伪狂犬病毒及其潜伏感染部位的研究

本研究合成了伪狂犬毒糖蛋白ｇｐ５０基因引笺，该引物能够扩增糖蛋白ｇｐ５０基因中４３４－６５１之间的２１７ｂｐＤＮＡ片段，该片段含 ＳａｌＩ酶切位点，应用引物对几种不同的伪狂犬病毒株多聚酶链式反应扩增结果全为阳性。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因保守区的核苷酸序列设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV野毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法。应用该方法检测猪常见病毒性病原(猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型),PRV gE基因缺失株,以及健康猪的组织,结果均为阴性,证明该方法特异性良好。该检测方法能够检到的阳性质粒模板最低浓度为254 copies/μL,最低病毒浓度为4.22 TCID_(50)/100μL,比常规PCR敏感性高10倍;重复性试验结果表明该方法重复性良好;用TaqMan实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时检测37份临床样品,其中前者检出阳性病料22份,阳性检出率为59.64%,后者检出阳性病料15份,阳性检出率为40.54%,2种方法的符合率为81.08%。综上所述,该方法的建立为PRV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的猪博卡病毒(PBoV)序列,通过VP1/2基因设计引物和Taq Man探针建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法与PPV、PRRSV及PCV均无交叉反应,具有较高特异性,在107 copies/mL～101 copies/mL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.997,最低可检测到101copies/mL的阳性质粒。说明所建立的PBoV实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性好和精确性高等优点。