小鼠SOCS3基因真核表达载体的构建及其对3T3-L1细胞凋亡的影响

【目的】探讨SOCS3对3T3-L1细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,用RT-PCR扩增SOCS3基因,将其克隆至pMD18-T Simple,构建pMD18-T-SOCS3重组质粒,经测序验证后,以pMD18-T-SOCS3为模板扩增SOCS3基因,将其克隆至pEGFP-N1,构建真核重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,测序正确后,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3转染3T3-L1细胞,荧光下观察GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3mRNA和蛋白的表达,观察细胞凋亡的变化。【结果】测序表明,pMD18-T-SOCS3和pEGFP-N1-SOCS3的核苷酸序列正确率为100%;在荧光显微镜下发现,脂质体组和SOCS3组均有GFP的表达;RT-PCR和Westernblotting检测表明,3T3-L1细胞中SOCS3mRNA表达显著提高(P<0.05);Hoechst 33258染色发现,SOCS3组的细胞凋亡显著;Bax和c-myc基因的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),bcl-2和mcl-1基因表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】SOCS3对脂肪细胞凋亡的发生有促进作用。     

贵州黑山羊COL1A1基因真核表达载体构建及其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔基因的影响

【目的】构建I型胶原蛋白α1链基因（COL1A1）过表达载体,并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响,为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础。【方法】通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段,然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1（+）线性化载体上,再通过酶切连接获得COL1A1基因全长,构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体;转染山羊卵巢颗粒细胞后,通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率,采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况,并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基（FSHB）]表达的影响。【结果】COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp,连接至pcDNA3.1（+）线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体。Western blotting检测结果表明,pcDNA3...     

Aha1基因过表达对黑色素瘤细胞凋亡的影响

目的 研究Aha1基因在恶性黑色素瘤形成过程中的作用.方法 采用定量PCR和免疫印迹的方法检测并比较小鼠B16F10移植恶性黑色素瘤及瘤旁的组织中Aha1基因的表达.在恶性黑色素瘤B16F10细胞中转染转染真核表达载体过表达Aha1基因后,使用CCK-8法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡.结果 Aha1在恶性黑...     

鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达

构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。     

猪Sar1b基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),获得pcDNA3.1( )-Sar1b重组载体.通过菌液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3.1( )-Sar1b构建成功.     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

新型冠状病毒Nsp1基因真核表达载体的构建及对宿主蛋白质翻译的影响

非结构蛋白1(Non-structural protein 1,Nsp1)作为新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）的毒力决定因子,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为更有效地研究SARS-CoV-2 Nsp1蛋白的生物学功能,成功构建SARS-CoV-2Nsp1基因的真核表达载体,并验证其抑制宿主及外源蛋白质翻译的功能。通过PCR技术扩增SARS-CoV-2Nsp1基因后,利用同源重组技术将其连接至pEGFP-N1载体上。经双酶切和测序结果鉴定,SARS-CoV-2Nsp1基因成功克隆至pEGFP-N1载体上。将重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1转染至HEK-293T细胞和HeLa细胞中,经嘌呤霉素标记后,利用Western Blot和考马斯亮蓝染色检测重组质粒的表达以及嘌呤霉素信号。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-SARS-CoV-2-Nsp1在HEK-293T细胞和HeLa细胞中成功表达,并验证其抑制宿主蛋白质和外源转入细胞蛋白质的翻译,为更深入研究SARS-C...     

人溶菌酶基因真核表达载体构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t为了阐明大额牛和牦牛胃型LYZ c基因的多态性及其对消化功能的适应。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t采用PCR产物直接测序技术,对35头大额牛和33头牦牛样品胃型LYZ c基因完整编码区序列进行了变异检测,并结合已发表的牛科物种同源序列进行了其对消化功能的适应性分析。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t在大额牛群体内共发现6个SNP位点,分别为c.196G>A、c.267T>C、c.270C>T、c.396C>T、c.423C>T和c.438C>G。在牦牛群体内共发现10个SNP位点,其中6个与大额牛共享,非共享的SNP位点分别为c.336G>C、c.348T>G、c.351T>C和c.375A>C。SNP196和SNP348为异义替换,引起p.G66S和p.H116Q氨基酸替换,但它们对大额牛和牦牛LYZ c的功能没有影响。在大额牛LYZ c基因中,共定义6种单倍型,确定了2种LYZ c蛋白变异体(Gayal 1和Gayal 2);而在牦牛LYZ c基因中,共定义12种单倍型,确定了3种LYZ c变异体(Yak 1~Yak 3);变异体Gayal 1与Yak 3、Gayal 2与Yak 1相同,而变异体Yak 2为牦牛独有。大额牛、牦牛和普通牛胃型LYZ c变异体之间在氨基酸组成、理化特性与结构上基本一致,但大额牛和牦牛变异体LYZ c等电点比普通牛S3型LYZ c更低。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t大额牛和牦牛胃型LYZ c蛋白可能更适合胃中的酸性环境,具有分解胃中微生物的功能。\t\t\t\t     

高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

民猪LPL基因真核表达载体的构建

为了进一步分析脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)基因的生物学功能。采用克隆测序的方法获得了民猪LPL基因的完整CDS序列,将其克隆到pMD-18T载体上,将测序验证正确的基因序列插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,构建了pcDNA-LPL真核表达载体。结果表明,所得序列与GenBank中登录的猪LPL基因同源性为99.30%,说明LPL基因的真核载体构建成功。该研究为在细胞水平上研究LPL的表达和功能奠定了试验基础,为进一步分析LPL基因功能提供了理论依据。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

为研究布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB的作用,以布鲁氏菌S2308基因组为模板,根据GenBank登录的BspA和BspB基因序列设计引物,利用PCR扩增BspA和BspB基因片段,并将其克隆至pEGFP-N1载体,获得真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB。真核表达载体经酶切和测序分析鉴定后,利用Lipofectamine^TM2000脂质体转染至胚胎滋养层细胞(HPT-8),采用Western blot(WB)检测BspA和BspB蛋白的表达,应用ELISA试剂盒检测细胞因子的分泌水平,利用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性水平。结果显示,BspA基因大小为576 bp,BspB基因大小为564 bp,真核表达质粒经限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ酶切验证正确,酶切产物经测序分析,显示与GenBank公布序列的同源性为100%;WB检测结果显示,pEGFP-BspA和pEGFP-BspB转染组分别在70 ku和68 ku处出现条带,与预期结果相符,表明BspA和BspB蛋白能在HPT-8细胞中表达;细胞因子检测结果显示,Bsp...     

萧山鸡IL-2基因真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因，将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2，高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号．用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验，可检测到特异性黄绿色荧光．SDS-PAGE和Western blotting可检测到18．5kD和14．5kD的蛋白条带．表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2，且表达产物具有免疫反应性，为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据．     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1的凋亡研究

UVB诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1不同时间后,用四氮唑盐法(MTT)和Hoechst染色及DNA-Ladder法分别检查BmE-SWU1细胞的增殖活性和凋亡情况.该实验研究了紫外线诱导对家蚕胚胎细胞BmE SWU1凋亡的影响,建立了紫外线诱导家蚕细胞凋亡的简单模型,为家蚕变态发育过程中细胞凋亡的研究奠定了基础.结果表明:UVB处理家蚕BmE-SWU1细胞后,细胞增殖活性随着照射剂量的增加而逐渐降低;光学显微镜下可见细胞膜表面突出或出现小泡,经Hoechst染色后,凋亡小体在荧光显微镜下清晰可见,细胞DNA电泳条带呈梯形分布,这是凋亡细胞典型的生化特征.     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.