哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达

根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应（PCR）方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEM-Teasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GST-OmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Western-blotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜蛋白OmpK可能是哈维氏弧菌的重要保护性抗原之一。     

哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

哈维氏弧菌TS-628菌株趋化性研究

采用平板趋化和毛细管趋化的方法,研究了病原性哈维氏弧菌TS-628菌株的趋化性。哈维氏弧菌对青石斑鱼肌肉、表皮黏液、肠黏液及血清的趋化性研究结果表明,该菌对青石斑鱼肌肉提取物的趋化性最强,且哈维氏弧菌的趋化运动明显受到温度、pH及盐度等环境因子的影响。哈维氏弧菌对青石斑鱼肌肉18种主要氨基酸的趋化性研究表明,该菌对其中多种氨基酸均表现出很强的趋化性,但氨基酸浓度也会对该菌的趋化性造成影响,浓度过高趋化性反而减弱。     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果

参照GeneBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp,编码214个氨基酸。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a( ),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为温度37 ℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1:30,000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为了进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果,构建了真核表达重组质粒pCDNA-OmpW,然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织均存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,红笛鲷不同组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明,红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western- blot分析表明,DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒试验结果表明,免疫保护率高达60 %,可见pCDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。     

半滑舌鳎源哈维氏弧菌分泌蛋白HutZ的功能鉴定及免疫原性

哈维氏弧菌为我国海水鱼类养殖过程中的常见病原,为了进一步探究哈维氏弧菌的致病机制,本实验分别从前期筛选到的哈维氏弧菌强毒株H2LB1和弱毒株H1SAI3中提取胞外产物(ECPs),并通过蛋白质组学进行差异蛋白鉴定.从中选取了哈维氏弧菌强毒株特异性蛋白HutZ为研究对象,对其功能和免疫原性开展深入研究.首先利用qRT-P...     

哈维氏弧菌Y91301菌株培养工艺的研究

用大黄鱼分离的哈维氏弧菌Y91301进行试验,研究接种浓度、培养瓶装液量、起始pH值、培养时间、培养温度和培养液配方等因素对菌株生长的影响,确定静置培养时最适条件为:接种母液浓度1×108～1×109cfu ml,接种量6%～8%(相对培养瓶装液量),装液量40～50ml 250ml,培养液初始pH值为6 0～6 5,培养温度28℃;使用Zobell2216E培养配方更适合大量培养和生产的需要;旋转培养能够获得更高的生物量。     

哈维氏弧菌生物膜生成的影响因素研究进展

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是弧菌病的主要病原菌之一,具有宿主范围广的特点.弧菌病具有发病率高、病死率高等流行特点.生物膜是哈维氏弧菌在自然界中存在的主要形式之一,在经历黏附、聚集后形成的成熟生物膜能够增强细菌对外界环境的抵抗力并扩散开来.菌液浓度、pH值、温度、渗透压等理化因素均对哈维氏弧菌生物膜的形成...     

哈维氏弧菌的分子遗传多样性研究

运用RAPD分型和BOX分型分子方法研究患病的海水鱼类体内和海水环境的101株哈维氏弧菌的分子遗传多样性。结果显示,从10个RAPD引物中发现只有PM2引物的分辨率和重复性较好,出现15条不同RAPD条带,在相似度65%下,101株哈维氏弧菌可以分为18种不同型;BOX分型出现20条不同的条带,在相似度为40%的情况下,可以把101株哈维式弧菌分15种不同的型;综合RAPD PM2和BOX分型,发现在相似度50%下,101株哈维氏弧菌可分18种型。综合RAPD和BOX分型数据可以很好地克服各自的缺点,得到更加准确的分型结果。     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联卵黄抗体的制备及体外抑菌效果的研究

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对三种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1:51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。综上所述,本研究制备的三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。     

哈维氏弧菌GYC1108-1胞外蛋白酶的制备及免疫原性研究

胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种不同佐剂与适量抗原混匀,分别免疫3只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。3次免疫后制备小鼠血清,间接ELISA测定抗体效价,除空白对照外,其他8组小鼠的免疫血清效价达1∶1.6×104～1∶2.56×105,免疫组的效价从高到低依次为弗氏白油蜂胶不加佐剂,不同佐剂的免疫效果依次为:弗氏白油蜂胶。免疫印迹实验结果表明,小鼠血清在55kD处有明显的反应条带。     

鱼用哈维氏弧菌亚单位缓释微球口服疫苗的免疫效果初探

通过复乳化-溶剂挥发技术,采用生物可降解性高分子材料聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK,制成缓释微球颗粒疫苗,口服免疫鲫鱼,测定其血清的凝集效价和相对免疫保护率.结果表明,制备的缓释微球疫苗直径＜10μm,且以粒径＜5μm的微球居多;微球中重组外膜蛋白OmpK包裹率达78.3%.鲫鱼口服微球疫苗2周后,血清抗体水平持续上升,第5周血清凝集抗体效价可达到与佐剂注射组相当的水平(28),抗体高峰期比注射组长1～2周,且降低较慢;免疫4周后用活菌攻击,口服组具有69.4%的相对免疫保护率,而对照组死亡率高达98%.结论为采用可生物降解的缓释微球作为鱼类亚单位口服疫苗的载体系统是可行的.     

虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是导致养殖对虾暴发弧菌病的重要病原之一。从我国南方养殖凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)分离、鉴定了10株哈维氏弧菌(Vh00947、Vh00949、Vh11011、Vh11014、Vh21217、Vh21218、Vh21220、Vh21229、Vh21231和Vh31487),分别肌注感染健康凡纳滨对虾后发现,菌株Vh21229致病性很弱,Vh00949其次,其它菌株毒力较强;对8种哈维氏弧菌常见毒力基因(Vh1、Vh2、Vh3、Vh4、tox S、hcp、zot和pap6)的检测显示,南方虾源哈维氏弧菌无论强弱毒株都很少携带zot、pap6、toxs和4种Vh基因(≤10%),表明这10个菌株的致病性与这7种常见毒力因子的相关度很低;hcp基因在所有菌株中均有检出,其中强毒株中检出率较高(50%),在较弱毒株(Vh00949)中也存在,表明hcp基因与这些菌株的致病性密切相关,但不是决定性因子。因此,这10株南方虾源哈维氏弧菌菌株的致病性差异应由这8种常见毒力因子以外的未知或未检测到的因子所决定。生化特征分析显示,所有菌株中只有弱毒株Vh21229不能利用D-甘露糖、蔗糖、D-海藻糖,而且只有其赖氨酸脱羧酶反应至阳性,而其它菌株均为阴性,推测导致哈维氏弧菌菌株生化特性改变的某种因子可能对菌株的致病性也产生了影响。药敏实验表明,10株哈维氏弧菌均对环丙沙星、氯霉素、恩诺沙星、美罗培南、头孢曲松、多西环素、头孢吡肟、诺氟沙星敏感,而对氨苄西林耐受性强,表明在虾类养殖过程中应当严格规范和控制抗菌药物尤其是青霉素类药物的使用。     

鱼用哈维氏弧菌亚单位缓释微球口服疫苗的免疫效果初探

<专刊>= <栏目>=研究论文 <图片>= <表格>= <连载>= <来源>= <中图分类号>=S942.2 <主题分类>= <行业分类>= <本刊专题>= <本刊编号>=1005-8737-(2007)07-048-05 <基金项目>=农业部农业结构调整重大技术研究专项(060503B)，广东省科技计划     

花鲈弧菌病病原菌（哈维氏弧菌）的分离与鉴定

1999年4－5月，山东省青岛市胶南海区网箱养殖场花鲈（Lateolabrax japonicus)幼鱼发生暴发性传染病，死亡率达50％。从具有明显症状的病鱼的病灶组织分离到1株优势菌SF－1，经人工感染和从人工感染发病的花鲈再分离的SF－3菌株的再感染试验结果表明，所分离的菌株为此次花钙烂层病的致病菌，经形态、生理生化等64项特征指标鉴定，SF－1和SF－3均为哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)。药敏试验结果表明，头孢噻肟，头孢三嗪，头孢孟多，呋喃妥因，氯霉素,氧哌嗪青霉素，磺胺类，复方磺胺、三甲氧苄氨嘧啶，多粘菌素E等10种药物对该菌株有明显的抑制作用。     

哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的研究

采用复性电泳技术,研究环境pH、温度及培养时间对哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的影响。结果表明,胞外产物蛋白酶最适反应pH在8.5左右,酸对ECP蛋白酶活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用;最适反应温度在20～50℃之间,20℃以下或50℃以上蛋白酶活性则受到明显抑制,表明蛋白酶不仅对高温敏感,对低温也很敏感;培养12h的胞外产物蛋白酶活性最强。最适温度和pH条件下,主要出现3种蛋白酶,其中分子量为94kDa和26kDa的两种蛋白显示了很强的蛋白酶活性,而且能在比较极端的温度和pH值条件下保持活性,而分子量为35kDa蛋白酶只在最适反应条件下出现,并且该蛋白酶的最适反应条件与弧菌病暴发时的环境条件极为相似。由此可推测分子量94kDa和分子量为26kDa的两种蛋白可能是弧菌维持生存所必需,而分子量为35kDa的蛋白酶虽然只出现在特定条件下,却可能在致病过程中起重要作用。     

斜带石斑鱼病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

从患病斜带石斑鱼 (Epinepheluscoioides)肝脏组织分离到EcGY0 2 0 4 0 1菌株 ,经人工感染、回归感染实验证实为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及 16SrRNA测序分析等综合鉴定 ,Ec GY0 2 0 4 0 1菌株为弧菌属哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi) ,其半致死剂量LD50 为 2 .7× 10 6CFU/g鱼体重。药敏试验结果表明 ,EcGY0 2 0 4 0 1菌株对利福平、四环素、喹诺酮类及头孢曲松等抗生素较为敏感