6种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较

为了比较市场上国产及进口非洲猪瘟病毒(ASFV)ELISA抗体检测试剂盒的产品质量和使用效果,本试验对B、C、D三种进口试剂盒和A、E、F三种国产试剂盒进行敏感性、特异性和重复性比较。结果显示,试剂盒B、D、E、F分析敏感性均为1∶512;试剂盒C分析敏感性为1∶256;试剂盒A分析敏感性为1∶128;诊断敏感性比较结果为试剂盒B>试剂盒D、F>试剂盒E>试剂盒C>试剂盒A;6种试剂盒对7份特异性质控血清的检测结果均为阴性,表明6种试剂盒均具有排除潜在交叉反应的病原抗体的能力;诊断特异性比较结果为试剂盒A、C、D>试剂盒F>试剂盒E>试剂盒B;批内重复性结果显示,6种试剂盒的批内变异系数(CV%)均在15%以内。结果表明,非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测国产试剂盒与进口试剂盒的敏感性、特异性和批内重复性相差无几,国产试剂盒的兴起解决了以往过度依赖昂贵的进口试剂盒的问题,国产化替代进程在不断加速。     

非洲猪瘟两种核酸提取方法的对比报告

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。目前,非洲猪瘟没有有效的疫苗。建立快速准确的诊断方法对于控制本病的传播至关重要。荧光PCR核酸检测是目前灵敏度最高的检测方法。而荧光PCR检测结果准确与否与非洲猪瘟核酸提取的质量有很大关系。笔者在检测工作中对农业部公布的常用快速检测试剂盒裂解液提取核酸与商品化试剂盒全自动核酸提取仪提取核酸,用同一检测反应液进行扩增,并从检测结果的准确性、操作简便程度、样品的使用范围、成本控制等方面进行比较,从而筛选出最佳的核酸提取方法,以期为非洲猪瘟疫情防控提供技术支撑。     

口蹄疫病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒的比较试验

本研究通过对深圳市场上常见的3个品牌(A,B,C)的口蹄疫病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒的外观和物理性状、特异性、灵敏度、重复性和稳定性符合率进行比对。结果显示,试剂盒A外包装完整,标签牢固且采用了具有隔热层的冻存管保存关键性试剂,包装较为科学;3家试剂盒中反应时间最长的C(61.75min)与最短的B(56.75min)相差5min;A,B,C试剂盒对口蹄疫阳性样本检测均呈阳性,对猪瘟等6种非口蹄疫阳性样本检测呈阴性;A比B试剂盒的检出Ct值提前1~2个Ct值,比C试剂盒检出Ct值提前1~4个Ct值;在样本浓度相对高时(稀释梯度≥2×10-4),3个厂家的试剂盒都较稳定,在样本浓度相对低时(稀释梯度在2×10~(-5)时),3个厂家试剂盒都有不同程度的不稳定,A试剂盒3个平行样均有阳性扩增,但其中一个样检出荧光增量相对较低;B和C试剂盒均出现无扩增样品。结论:3家试剂盒中,A产品使用具有隔热层的冻存管保存关键性试剂,且灵敏度较高、特异性较强、稳定性较佳,适用于临床检测。     

保存液对唾液样品中非洲猪瘟病毒核酸保护效果的研究

本实验旨在评价保存液对唾液中非洲猪瘟病毒核酸的保护效果。通过以下分组进行实验:A组,5 ml唾液+50μl阳性样本(100倍稀释);B组,5 ml唾液+5μl阳性样本(1000倍稀释);C组,棉签沾取100倍稀释样品放入保存液;D组,棉签沾取100倍稀释样品放入生理盐水;E组,原唾液(空白)样本。在1 h、7 h、22 h和35 h这个四个时间点,分别通过柱式和磁珠法提取非洲猪瘟病毒的核酸,并通过荧光定量PCR检测样品中的病毒核酸含量,结果表明,无论是柱式法还是磁珠法提取,A、B和D组的Ct值随着时间推移均在变大,而C组(保存液)Ct值趋于稳定,说明保存液对非洲猪瘟病毒降解具有一定的减缓效果。     

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限(LOD)、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒(A、B、C)的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示：3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数(R²)分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10^-1～10^-2 copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长(105 min),LOD为10^-2 copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异(P> 0.1),批内变异系数(CV)在1.5%以内。结果表明：3种荧光PCR检测试剂盒的综...     

不同厂家试剂盒检测猪A型口蹄疫抗体的对比试验

为了对不同厂家试剂盒检测猪A型口蹄疫抗体的敏感性及与兰州兽医研究所(以下简称为兰兽研)猪A型抗体试剂盒检测的一致性进行综合比较,试验从湖南省湘潭市某猪场采集血清样本328份(其中母猪血清268份,育肥猪血清60份),使用A、B、C厂家的试剂盒,同时使用兰兽研试剂盒作为对照,按照各厂家试剂盒说明书对所有血清进行猪A型口蹄疫抗体测定及结果判定。结果显示,母猪FMD-A型抗体阳性率数值,试剂盒A试剂盒C试剂盒B兰兽研试剂盒;育肥猪FMD-A型抗体阳性率数值,试剂盒A兰兽研试剂盒试剂盒C试剂盒B;以兰兽研检测结果为参照,FMD-A型抗体阳性符合率数值试剂盒A试剂盒C试剂盒B;FMD-A型抗体阴性符合率数值试剂盒B试剂盒C试剂盒A。综合三种试剂盒的敏感性和一致性来看,试剂盒A的检测敏感性及与兰兽研的阳性一致性最高,试剂盒C次之;试剂盒B与兰兽研的阴性一致性最高,试剂盒C次之;三种试剂盒的检测敏感性及与兰兽研的一致性相差不大。     

部分商品化非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的比对

为获得商品化非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR检测试剂盒的敏感性、特异性、一致性和最低检测限等试验数据,以世界动物卫生组织(OIE)推荐引物探针为金标准,以62份已灭活的ASFV阳性田间样品、32份阴性田间样品和P72基因核酸标准物质为检测对象,对农业农村部公布许可的其中17个厂家生产的商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒开展了试验特性方面的比对研究。结果显示,17个厂家生产试剂盒的敏感性最低为77.4%,最高为96.8%,特异性最低为87.5%,最高为96.8%,均未达到100%,且有一定差别;12个厂家的试剂盒与OIE推荐引物探针检测结果一致性较好(Kappa值≥0.75),其余5个厂家的试剂盒与其一致性一般(0.4Kappa值0.75);17个厂家的试剂盒均可检测到的最低稀释度为5.9×10~3×2~(-3)拷贝/μL,但不同厂家试剂盒的最低检测限有所差别,其中5个试剂盒可检测到的最低稀释度为5.9×10~3×2~(-3)拷贝/μL,2个试剂盒为5.9×10~3×2~(-4)拷贝/μL,6个试剂盒为5.9×10~3×2~(-5)拷贝/μL,3个试剂盒为5.9×10~3×2~(-6)拷贝/μL,1个试剂盒至少为5.9×10~3×2~(-7),且大部分国产试剂盒的最低检测限比进口试剂盒低。本研究为ASFV荧光PCR检测试剂盒的筛选和比对提供了参考数据。     

不同非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒在检测猪肉及猪肉制品中的比较

为了解不同非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒在检测猪肉及猪肉制品中的特征,采用国内外6种商品化非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒,分别对同一样本开展稳定性试验,对相同非洲猪瘟强阳性、中阳性及弱阳性样本开展敏感性试验.结果显示:6种试剂盒扩增稳定性良好;对强阳性样本,所有商品化试剂盒均能检出;对中阳性及弱阳性样本,特别是...     

县级实验室非洲猪瘟病毒荧光PCR免提取检测操作规范及注意事项

武宣县动物疫病预防控制中心兽医实验室从2020年2月至7月用免提取试剂盒检测了非洲猪瘟病毒感染可疑样品1. 36 万份,结果阳性检出0份.期间检出假阳性3 次,阳性对照组不成立2次,后来经两名实验人员分别用不同厂家的试剂盒进行复检结果均为阴性.笔者认为县级兽医实验室技术人员在非洲猪瘟病毒荧光PCR免提取实验时,实验前准...     

非洲猪瘟病毒检测试剂盒的研制

针对非洲猪瘟病毒（ASFV）P54基因建立荧光PCR检测方法,通过优化引物、TaqMan探针浓度及反应温度,研发了ASFV检测的荧光PCR检测试剂盒。经灵敏度的重复性试验及3种不同型号荧光PCR仪使用验证,所研发的试剂盒灵敏度为101copy/μL,适用于不同型号荧光PCR仪使用,可用于对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

应用非洲猪瘟病毒基因质粒标准物质评价荧光PCR试剂盒及核酸提取方法

为评价不同检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的检测性能,以及不同提取方法对ASFV核酸的提取效率,本研究以国家标准物质“ASFV B646L基因质粒标准物质”作为模拟样品,通过荧光定量PCR检测,比较扩增曲线、Ct值等指标,分析了4个厂家的5种试剂盒的敏感性、重复性及反应耗时等检测性能,同时比较了磁珠法与柱式法等2种核酸提取方法的提取效率。结果显示：5种试剂盒均能有效检测出不同浓度的ASFV B646L基因质粒标准物质,不同的试剂盒最低检测限不同,最低的试剂盒为5.8×10^-1 copies/μL,线性关系最优的试剂盒R~2=0.997,各试剂盒实际反应时间与理论时间均有差异。2种提取方法均可有效提取ASFV B646L基因质粒标准物质,其中柱式法的提取效率高于磁珠法,但柱式法的离散度大于磁珠法。综上,4个厂家的5种试剂盒及柱式法与磁珠法均可使用ASFV B646L标准物质作为基准进行试剂盒性能及提取效率评价。在实际检测中,应根据具体情况选择合适的检测试剂盒及核酸提取方法。     

基于非洲猪瘟病毒标准物质的荧光PCR检测试剂盒初步评价

为探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)标准物质作为试剂盒评价体系的可行性,比较了市场上5种主流品牌ASFV荧光PCR检测试剂盒的检测性能。使用ASFV P72基因核酸标准物质作为模板,根据5种试剂盒说明书分别进行相应的荧光定量PCR检测,结合扩增曲线、Ct值,分析不同试剂盒的敏感性、可重复性以及所需反应时间。结果显示:5种试剂盒的阴性、阳性对照均成立,最低检测限均为5.9×10^-1拷贝/μL;4个厂家的试剂盒线性关系R2>0.98,其中最优的R²=0.994,离散度最小;各试剂盒的实际反应耗时与理论反应耗时均有一定差异(0.20~0.96 h)。结果表明,各生产厂家使用P72基因作为靶基因研制的ASFV荧光PCR检测试剂盒都可以使用ASFV标准物质作为评价体系,来评判试剂盒的检测性能。本试验为各实验室不同样品检测的ASFV荧光PCR检测试剂盒选择提供了一种可用的评价方法。     

非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

为提升兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力和质量控制水平,积累检测经验,以更好地开展非洲猪瘟检测,2020年7月,参加了北京市农业农村局组织的"非洲猪瘟实验室检测能力比对"项目.本次比对同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》(SNT 1559—2010标准)中的普通PCR方法、荧光定量PCR方法以及商品化试剂盒,对5份验证样品...     

非洲猪瘟检测样品的选择

为了选择非洲猪瘟病毒感染早期、中期和晚期3个阶段诊断的最佳样品,试验选取50头临床表现为采食量下降或不食、发烧、流产的母猪为研究对象,采集其环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血等6种样品共900份,采用定量PCR方法检测非洲猪瘟病毒核酸,比较6种样品中核酸的阳性率和Ct值。结果表明,感染早期的咽拭子非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率最高为42%;中期血液中非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率为25%;后期环境样品中非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率最高为54%,血液病毒载量最高。综合现场操作,认为非洲猪瘟诊断中,不同时期选择的最佳样品分别是:感染前期采集咽拭子进行检测,中期采集尾根血进行检测,后期采集环境样品进行检测。     

几种检测猪弓形虫病ELISA诊断试剂盒的对比

以人工感染弓形虫的猪阳性血清及感染前的阴性血清为样品,比较3个国产(A、B、C)和2个国外(D、E)ELISA试剂盒检测猪弓形虫病的敏感性。用这5种ELISA试剂盒,检测人工感染弓形虫的猪阳性血清42份及感染前的阴性血清45份,并参考PCR扩增结果,比较这5种ELISA试剂盒检测猪弓形虫病的敏感性。5种试剂盒中,1种国产试剂盒的检测结果与PCR结果完全一致,其余4种试剂盒的检测结果都与PCR检测结果差别较大。结果表明,国产试剂盒A的检测效果最佳,国外试剂盒与部分国内试剂盒的检测结果相当,临床选用试剂盒时,可选择检测效果最佳的试剂盒A,不必盲目选择国外试剂盒。     

不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒比对

为评价不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的效果,选择当前市场上6个厂家的商品化试剂盒,检测不同类型样品,结合统计学方法对试剂盒的特异性、敏感性和重复性等性能指标进行比对分析。结果显示：6个厂家的试剂盒ROC曲线下区域面积(AUC)为0.826～0.951,Youden指数为0.76～0.90,说明试剂盒的排他性和包含性等特异性指标总体表现较好;最低检出限(LOD)等敏感性数据显示,6个厂家试剂盒的LOD为10^-1～10² copies/μL,说明各试剂盒的敏感性均较理想;用高、低浓度样品对试剂盒分别进行批内、批间重复性试验,发现高浓度样品的批内、批间变异系数(CV)为0.10%～1.28%,说明重复性较好,仅有2个厂家的试剂盒在检测低浓度样品时表现较好,批内CV为2.25%～6.12%,批间CV为2.93%和4.93%,说明不同试剂盒检测低浓度样品时稳定性较差。本研究为商品化荧光PCR检测试剂盒的评价提供了参考。     

4种玉米赤霉烯酮ELISA试剂盒的质量评估

为了解市场上玉米赤霉烯酮ELISA试剂盒的质量状况,指导试剂盒的正确选择和使用,研究选择市场上常见的4种试剂盒(A、B、C和D)进行质量评估,分别评价试剂盒的准确度、精密度、灵敏度、标准曲线线性和实际样品检测能力。结果显示:试剂盒B的回收率最好(100.62%~114.29%);试剂盒A批内变异系数小于5%,B、C和D小于10%,批间变异系数除试剂盒B低质量浓度添加组外均小于10%;试剂盒A的灵敏度最高而D最低;除试剂盒D的线性相关系数R2(0.987 1)小于0.99外,其他3种试剂盒(A、B和C)的R2均在0.99以上,分别为0.998 9、0.999 5和0.990 5;实际样品检测能力B最高,A和D次之,C最低。4种试剂盒质量虽有不同,但除C外其他3种试剂盒均能满足检测要求,且这3种试剂盒使用说明书标示的质量参数与实际测定值相符;另外,同一品牌不同批次的试剂盒之间存在质量差异。     

3种核酸提取试剂盒对猪不同样品RNA病毒核酸提取效果的比较研究

为了筛选出高效、低成本、用时短的RNA核酸提取试剂盒,为各级实验室开展动物疫病监测提供参考,试验选择3种常用磁珠法核酸提取试剂盒(病毒DNA/RNA提取试剂盒A、病毒RNA提取试剂盒B及病毒总核酸提取试剂盒C)对临床粪便样品提取猪流行性腹泻病毒RNA、临床组织病料样品提取猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA,通过实时荧光定量反转录(RT)-PCR方法进行检测,以Ct值评价分析提取效率及重复性,同时对不同试剂盒提取时间及价格进行综合比较分析。结果表明:对于粪便样品,B、C试剂盒的RNA提取效率要高于A;3种试剂盒对PRRSV浓度较高的组织样品均具有较好的提取效果,A、B试剂盒的RNA提取效率高于C试剂盒,但B、C试剂盒的重复性优于A试剂盒。其中A试剂盒对于组织样品中高浓度病毒样品提取效率较高,时间最短;B试剂盒对于粪便样品中低浓度RNA病毒提取效率最高,但价格最贵,且时间最长;C试剂盒对粪便中低浓度样品RNA提取效率高于A试剂盒,价格最低。综合提取效率、时间及成本等因素分析认为,试剂盒C性价比较高,可用于大批量临床样品检测。说明不同试剂盒对不同种类样品提取后,提取效率存在差异,实验室可根据实际情况进行选择。     

抗原ELISA检测试剂盒和胶体金试纸条用于禽白血病病毒检测时的比较

为比较不同禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)抗原ELISA检测试剂盒和胶体金试纸条的灵敏度,本研究将A、B、J 3种不同ALV亚群分别以50,100,500TCID503种剂量接种培养于DF1细胞上,接种后2~8d,每天收取上清,每份上清用3种不同的抗原ELISA检测试剂盒(A、B、C)和2种胶体金试纸条(D、E)同时检测。结果显示,3种亚群3种剂量分别应用A、B、C 3种ELISA检测试剂盒,灵敏度基本一致,但在针对3种亚群的个别剂量时B试剂盒灵敏度略高于A和C;2种胶体金试纸条检测结果完全一致,但其灵敏度均比ELISA试剂盒低,检出时间延后1~2d。同时应用ELISA试剂盒A、B和胶体金试纸条D、E对60枚种蛋蛋清进行了检测,结果显示胶体金试纸条检出率远低于ELISA试剂盒检出率,在某些应用方面还无法完全替代ELISA检测试剂盒。本研究为广大种鸡场开展禽白血病净化选择灵敏度高、操作简便的检测方法及其适用范围提供了借鉴。     

检测猪瘟病毒的商业化荧光PCR试剂盒比对验证

为了比较猪瘟病毒6种荧光PCR检测试剂盒的使用效果,本研究采用标准毒株、疫苗与猪瘟阳性组织3类样品,对这些试剂盒的敏感性、特异性、重复性及有效期符合率进行比较。结果显示,试剂盒差异较大,仅有国外试剂盒和2家国产试剂盒与预期的结果一致,其对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型以及阴性猪样品的核酸无交叉反应,重复性与再现性均为理想,在有效期内检测结果没有发生变化。本研究开展检测猪瘟病毒试剂盒验证试验,这将为猪瘟的病原学诊断及实验室开展其它试剂盒验证提供参考。