J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。     

PCR／PFLP鉴别伉禽白血病病毒

用PCR方法从禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALY）亚群毒株RAV－1、RAV－2感染或未感染的SPF鸡胚成纤维细胞（CEF）分别扩增出1．2kb基因手段。RAV－1囊膜基因可初BglⅡ分为2条相近的600bp片段，RAV－2囊膜基因被BamHI分为2条约600bp片段，对照组基因片段（内源性病毒）不被BglⅡ和BamHI切割。结果显示，ALV囊膜基因PCR／RFLP可用于诊断禽白血病和鉴别不同的AVL毒株。     

禽白血病病毒研究进展

禽白血病是由禽白血病病毒 ( avian lekosis virus,ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类传染病 ,包括淋巴细胞性白血病 ,成红细胞性白血病 ,成髓细胞白血病和髓细胞样白血病 ,对养禽业危害最大的是禽淋巴细胞性白血病 ( lymphoid leukosis,LL)。自 1 90 8年首次报道并分离到 ALV以来 ,世界上许多国家都有该病的流行和发生 ,其垂直和水平传播引起临床和亚临床感染而造成较大的经济损失 [1 ,2 ]。近年来 ,随着分子生物学技术的广泛应用 ,在该病毒的囊膜基因、病毒受体、致病机理、内源性白血病病毒和培育 ALV抗性鸡等方面取得了不少…     

一种弓形虫单管套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊应用

根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收录的相关序列同源,而与山羊泰勒虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫基因组无交叉反应,该方法能够检测出DNA的最小量为1fg。使用该方法对137份奶山羊血液样品进行了检测,发现有38份为阳性。本研究所建立的方法具有特异性强、敏感性高的特点,可用于奶山羊弓形虫病的诊断,有较高的临床应用价值。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

禽白血病的PCR检测

试验根据禽白血病病毒群特异性抗原P27基因合成引物,经PCR反应条件的优化,针对来源于不同养殖场病料样本的P27基因进行PCR扩增,结果ALV–J抗体阳性鸡血液样本、ALV–J抗体阴性鸡血液样本、疑似病例肝脏和正常鸡肝脏中的病原核酸检出率分别为50.0%、0、90.0%和61.5%.同时将扩增的目的基因进行克隆测序,并与GenBank中的参考毒株进行比较,结果表明目的基因片段序列长793 bp,与参考毒株核苷酸序列同源性分别为99.2%、97.6%.     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

内源和外源性禽白血病病毒鉴别PCR检测方法的建立

为建立简单快捷的内、外源性禽白血病病毒(ALV)的鉴别检测方法,本研究根据外源性ALVA亚群标准株RAV-1的p27、env基因以及内源性ALVE亚群标准株ev1的env基因的保守序列,设计3对特异性引物,可分别对ALV、外源性ALV(A、B亚群)和内源性ALV(E、J亚群)进行扩增,扩增产物分别为793bp、387bp和234bp,通过对各反应条件的优化建立了同时检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR方法。该方法特异性良好、灵敏度可达到2×103copies,利用该方法和ELISA对5份现地病鸡组织样品和10枚疑似感染内源性ALV的鸡胚进行检测,结果表明:4份病鸡样品均扩增出3条特异性片段;而9枚鸡胚仅扩增出793bp和234bp的特异性片段,2种检测方法的符合率为100%。该方法为内、外源性ALV的临床鉴别诊断奠定了基础。     

J亚群禽白血病多发性肿瘤的病理改变与POR检测

两个规模化商品蛋鸡场发病鸡群临床解剖显示：脚部和翅膀有血管瘤、肌肉组织内出现纤维肉瘤,肿大的肝、脾出现髓细胞瘤;经组织病理学观察符合J亚群禽白血病（ALV-J）的病理学特征。针对ALV—J保守序列P27基因设计特异引物,建立PCR方法,从出现病理改变的各组织脏器、各多发性肿瘤中以及血液中均检测到ALV-J,证实该病为以髓细胞瘤,血管瘤和纤维肉瘤为主的多发性肿瘤传染病。对扩增产物序列进行测定后,与原型株序列进行比较,核苷酸同源性为98．27％,从分子水平上证明为J亚群禽白血病,用PCR检测进一步验证J亚群禽白血病毒的感染机制和引起鸡群的病理改变。     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

J亚群禽白血病病毒的免疫荧光检测效果

应用特异性抗J亚群禽白血病病毒（ALV－J）的单克隆抗体JE9建立了免疫荧光检测ALV－J抗原和抗体的方法。结果表明，在ALV－JADOL－Hcl感染鸡胚成纤维细胞（CFF）24小时后，可以用1FA检测出阳性细胞，感染72小时后，可以检测出最小病毒感染量≥1．25TCID50／孔。对人工感染ALV－J鸡肾脏冰冻切片检测结果证明，免疫荧光法可以检测出组织中的ALV－J抗原，表现强阳性反应。用重组病毒rBac4817－env感染的Sf9细胞作抗原，可以检测出鸡血清中抗ALV－J的特异性抗体。该方法在ALV－J的控制中必将产生重要作用。     

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。     

禽白血病病毒亚群重组囊膜蛋白基因的表达效果

用ELISA法测定了重组杆状病毒rBac-4817env感染的Sf9细胞中重组囊膜蛋白基因的表达效果。用特异性抗禽白血病病毒J型群（ALV-J）单克隆抗体JE9荧光染色证明了重组病毒能够在感染的Sf9细胞中表达ALV-J的env基因；糖基化抑制试验的结果表明，Sf9细胞表达的env基因产物是一种糖基化蛋白。不同量的重组病毒感染细胞与基因产物的表达产量无正相关，然而当每个细胞感染的病毒量2-800个时，表达产量相对较好。表达产物以感染后72-96h较高，并随着感染时间的延长，分泌到细胞外的重组基因产物有所增加，但在120h后，表达产物分解增加。研究结果对今后获取大量的基因的产物，并对其特性进一步研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测方法建立

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原体.为建立一种灵敏度更高且特异性更强的分子检测技术,研究建立一种猪圆环病毒2型单管巢式PCR检测技术.首先利用梯度PCR方法验证内外引物的最佳退火温度;再利用正交试验设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓...     

应用聚合酶链反应检测禽多杀性巴氏杆菌的研究

根据基因库中禽巴氏杆菌病原的基因序列（U51470）,设计了一对跨幅为488bp的引物,并用这对引物对11个不同血清型的禽巴氏杆菌标准株、9株地方分离株和5株哺孔动物巴氏杆菌菌株及其它6种禽病病原进行了PCR扩增,结果11个血清型的禽源巴氏杆菌和9株禽巴氏杆菌地方分离株均得到了片段大小与实验设计相一致的PCR扩增产物,而对5个血清型的哺乳动物巴氏杆菌和其它6种禽病病原的扩增结果为阴性。该PCR能检出10pg的禽巴氏杆菌DNA模板。     

应用PCR/RFLP技术对广西禽白血病病毒的检测与分型研究

对2000～2003年间从广西的南宁、玉林、桂林、钦州、柳州、梧州等地采集的有肿瘤/可疑肿瘤的250份鸡病例进行肿瘤病的检测.结果发现,外源性禽白血病阳性的有32份,阳性率为12.8%.其中,同时为马立克氏病阳性的有30份,两者共感染率高达93.75%(30/32);根据禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因的限制性片段长度多态性分析,对其中20份外源性禽白血病病毒进行分型鉴定,结果证实全部属于A亚群.     

J亚群禽白血病病毒与粪肠球菌混合感染的诊断及相关基因分析

为了解贵阳市某养殖场J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)gp85基因的变异情况及粪肠球菌(Enterococcus faecalis,EF)毒力基因的携带情况,本研究对该养殖场ALV与粪肠球菌混合感染的病例展开了病原学调查分析,采集病料进行病毒核酸检测、gp85基因克隆测序分析、核苷酸序列相似性分析、细菌分离鉴定、毒力基因检测等。结果显示,成功克隆出ALV gp85基因并分离鉴定出1株粪肠球菌,分别命名为GZM52021株和GZEF2021株。ALV核酸检测仅在约422 bp处出现特异性扩增条带,说明存在ALV-J感染;成功克隆ALV gp85基因,且GZM52021株与J亚群参考毒株gp85基因(GenBank登录号为KM655820、KF796654、JN378888和Z46390)的相似性较高,在97.9%~98.2%之间;gp85基因核苷酸序列遗传进化树构建结果与相似性结果一致。GZEF2021株在LB 固体平板上长出圆形凸起、不透明的乳白色菌落,在鲜血琼脂平板上有明显的溶血现象,革兰氏染色镜检为球形或卵圆形阳性链状球菌;16S rRNA测序结果显示,GZEF2021株与粪肠球菌(GenBank登录号为KJ626240、MT611693、KY399248、MH919370、MN379663和KU937389)的相似性均在99%以上;药敏试验结果显示,GZEF2021株对头孢哌酮、青霉素、哌拉西林和羧苄西林4种药物敏感,对复方新诺明、头孢拉定、头孢唑啉3种药物中度敏感,对新霉素、丁胺卡那、多西环素和米诺环素4种药物耐药;毒力基因检测显示,GZEF2021株携带有ace、gelE、asa1、EF3314和efaA 5个毒力基因,说明从鸡中分离出的粪肠球菌可能具有一定的致病性。该病死鸡存在J亚群ALV与粪肠球菌共同感染的情况,本试验结果可为了解J亚群ALV和粪肠球菌在贵州的流行趋势及其混合感染的诊治提供一定的参考资料。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。