H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒构建

本试验构建了H9亚型禽流感病毒HA基因禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7kb的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,用H9亚型禽流感病毒多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫原性评估

本研究以细胞感染-转染技术构建了一株表达H7亚型禽流感病毒(AⅣ)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒rFPV-HA.以5×105PFU的rFPV-HA经翅下刺种免疫8周龄SPF鸡,免疫后第3周用100 CID5o的HA基因同源AⅣ A/Arfi St/eng-Q/983/79(H7N1)进行人工感染,1周后采集泄殖腔棉拭子进行病毒分离.免疫后第三周及攻毒后第1、2周对所有动物进行静脉采血,检测血凝抑制(HI)抗体和免疫沉淀(AGP)抗体.结果,攻毒前部分rFPV-HA免疫鸡可检测到HI抗体,但检测不到AGP抗体,野生型病毒(F017)接种组和空白对照组HI抗体和AGP抗体均为阴性.攻毒后rFPV-HA免疫组的HI抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组.rFPV-HA免疫组有6/8的鸡为流感病毒分离阴性,野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性.结果表明rFPV-HA可诱导鸡产生有效的免疫保护反应,阻止或降低消化道病毒排泄.rFPV-HA的成功构建为研制开发H7亚型禽流感活载体疫苗奠定了良好的基础.     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。     

禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达

将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护.     

鹅细小病毒VP3基因与鹅γ干扰素基因在重组禽痘病毒中的共表达

为了构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因与鹅IFNγ基因的重组禽痘病毒,本研究将GPV-VP3基因和鹅IFNγ基因克隆到禽痘病毒转移载体中,构建串联基因的禽痘病毒转移载体pSY-GoIFNγ-VP3,采用脂质体法将其转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑法筛选重组病毒,并进行8轮蚀斑纯化,以及PCR鉴定和间接免疫荧光(IFA)分析。结果表明,所获得的重组病毒rFPV-GoIFNγ-VP3能稳定表达外源基因。本研究为进一步开展GPV重组禽痘病毒疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建

采用RT－PCR技术扩增了禽流感病毒A／Guangdong/3/96(H5N1)[GD3/96]神经氨酸酶（NA）基因，并将其克隆到pUC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸，从pUCNA中切下NA基因片段，将其亚克隆到质粒pSY538的EcoR I位点，将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的Sma I位点，然后切下同位含有NA及LacZ基因的片段，再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的Not I位点，经限制性内切酶分析，PCR鉴定等，证明含有禽流感病毒NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功，从而为进一步筛选表达NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性鉴定了实验基础。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒在水禽的免疫效力

利用表达 H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒 ( r FPV- HA)和油乳剂全病毒灭活疫苗分别接种商品鹅 ,评价疫苗在水禽的免疫保护作用。结果发现 ,免疫后 2 1 d,r FPV- HA免疫组 HI抗体检测为阴性 ,灭活疫苗免疫组HI抗体阳性率为 70 % ;用 H5亚型禽流感病毒攻击后 ,与阴性对照组相比 ,r FPV - HA免疫组鹅的口腔和泄殖腔排毒率降低 ,病理变化减轻 ,感染鹅易康复 ,保护率为 80 % ,总体保护效力达到灭活疫苗水平。结果表明 r FPV - HA免疫家鹅可诱导良好保护 ,显示出了良好的应用前景     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

免疫剂量和母源抗体对禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫效力的影响

利用表达 H 5亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素基因的重组鸡痘病毒 (r FPV- HA)以不同剂量免疫 1日龄 SPF鸡、有或无母源抗体 (FPV、AIV H5)的商品鸡 ,并于免疫后 2 1d利用同亚型 AIV通过肌肉注射进行致死性攻击 ,通过检测免疫后 HI抗体应答、比较攻毒后发病率和死亡率评价免疫剂量和母源抗体对 r FPV- HA免疫效力的影响。结果发现 ,免疫后 2 1d,15 %～ 2 0 %的 SPF鸡和无母源抗体商品鸡可检出 HI抗体 ,而含母源抗体商品鸡检测不到 HI抗体。利用H5亚型 AIV致死性攻击后 ,10 3～ 10 6 PFU的 r FPV- HA可保护 95 %～ 10 0 %的 SPF鸡和无母源抗体商品鸡抵御强毒攻击 ,使之免于发病和死亡 ;而不同剂量 r FPV- HA接种的含母源抗体商品鸡有 80 %～ 90 %发病和死亡。结果表明 ,在较宽的免疫剂量范围内 ,r FPV- HA对 SPF鸡和无母源抗体商品鸡可提供良好的保护 ,显示出一定的应用前景 ;母源抗体影响 r FPV- HA诱导的免疫应答 ,且提高免疫剂量亦不能克服其干扰作用 ,这提示在实际应用中需优化免疫程序 ,避免母源抗体干扰。     

检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

H5亚型高致病性禽流感疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)和全病毒灭活疫苗免疫商品鸡，比较两种疫苗的保护效力。结果发现，利用10^3PFU和10^6PFU的rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡和含母源抗体商品鸡，HI抗体应答水平均低于灭活疫苗免疫组。利用H5亚型禽流感病毒经肌肉注射攻毒后，rFPV-HA免疫的无母源抗体商品鸡获得了完全保护(100％)，高于灭活疫苗保护率(94.7％)；但rFPV-HA免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率(11.4％～15.8％)低于灭活疫苗免疫组的保护水平(68.4％)。结果表明，rFPV-HA诱导HI抗体的能力低于灭活疫苗；但rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡的保护率完全达到灭活疫苗保护水平，显示出了良好的应用前景；灭活疫苗和rFPV-HA均受到母源抗体的干扰，不适于在母源抗体处于高峰期时使用。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。