琥珀蚕内参基因的克隆及表达稳定性检测

琥珀蚕(Antheraea assama)是一种重要的野蚕种质资源。为了开展琥珀蚕功能基因的研究,选择合适的内参基因非常必要。通过c DNA末端快速扩增技术获得琥珀蚕功能基因研究的3个常用内参基因β-actin、GAPDH和18S rRNA的c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析3个基因在蚕体不同组织中的转录水平,并利用标准化分析软件ge Norm和Norm Finder分析其表达的稳定性。结果显示,3个内参基因的表达稳定性依次为β-actin、GAPDH、18S rRNA。就组织表达而言,β-actin在幼虫的中肠、脂肪体、马氏管、气孔、丝腺和卵巢以及蛹的输卵管中表达相对稳定;就发育时期的表达而言,β-actin在蛾期的表达也相对稳定。此外,GAPDH在幼虫头部、表皮和血液中的表达相对稳定;18S rRNA在幼虫精巢中的表达相对稳定。对琥珀蚕功能基因表达进行qRT-PCR所需内参基因数量的分析表明,选用2个内参基因即可满足试验需求。     

H5N1禽流感病毒感染小鼠后内参基因的筛选

本研究旨在评定H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus,H5N1 AIV)感染小鼠后,脾脏组织中6个候选内参基因酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1,Hprt1)、琥珀酸脱氢酶A亚基(succinate dehydrogenase flavoprotein subunit,Sdha)、β-肌动蛋白(β-actin,Actb)、肽基脯氨酰异构酶A(peptidyl prolyl isomerase A,Ppia)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)的稳定性。通过H5N1 AIV强毒株A/DK/GD/378/08感染小鼠,采用Real-time PCR方法分别于12、24、48、72、96、120和144 h检测感染组与对照组中6个候选内参基因的表达水平,然后用Genorm软件对内参的稳定性进行评价。结果表明,正常小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ywhaz/Hprt、Sdha、Actb、Ppia、18S rRNA;H5N1 AIV感染的小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ppia/Sdha、18S rRNA、Hprt、Ywhaz、Actb;综合评价正常和H5N1 AIV感染后小鼠脾脏组织中6个内参基因的表达稳定度由高到低分别为Sdha/Hprt1、Ywhaz、Ppia、Actb、18S rRNA。因此,小鼠脾脏组织中Ppia和Sdha是研究H5N1 AIV在机体中复制时最理想的2个内参基因;Sdha和Hprt1则是在研究H5N1 AIV与机体相互作用时最理想的2个内参基因。     

白羽王鸽不同组织RT-qPCR内参基因的筛选

内参基因的正确选择是获得精准、可靠RT-qPCR数据的重要前提。本研究随机选取3只28日龄的白羽王鸽,采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、腹脂、卵巢9个组织作为实验材料,选取GAPDH、β-actin、18S rRNA和RPS24个常见的内参基因作为候选内参基因。利用RT-qPCR技术和geNorm、NormFinder、BestKeeper软件及Ct值分析法对候选基因在不同组织中的表达进行检测和稳定性分析。结果表明:geNorm、NormFinder软件分析与Ct值分析法的结果一致,即18S rRNA基因稳定性最佳,RPS2次之;BestKeeper软件的分析结果显示RPS2基因表达稳定性最好,18S rRNA基因次之。因此,推荐选择RPS2+18S rRNA的内参基因组合用于白羽王鸽不同组织基因表达的研究。     

角蛋白26基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的表达差异

采用超细型和细型细毛羊皮肤组织为试验材料,以18S rRNA、β-actin、GAPDH等基因为内参,角蛋白26(keratin 26,KRT26)为目的基因,建立了基于SYBR Green Ⅰ染料技术的Real-time PCR检测体系,并分析KRT26基因在不同细度绵羊皮肤组织中的表达差异。结果表明,以cDNA为模板建立的标准曲线循环阈值(Ct)与标准cDNA模板在一定浓度范围内呈良好的线性关系,当以18S rRNA、β-actin、GAPDH作为内参基因时,KRT26基因在超细型细毛羊皮肤组织中的表达水平是细型细毛羊皮肤组织中的1.5倍。初步确定KRT26基因与毛细度具有相关性,这将为进一步研究分子育种和绵羊毛纤维细度性状的改良提供依据。     

家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析

本研究旨在筛选出新西兰白兔不同时期不同器官中表达最稳定的内参基因。以胚胎期(E28.5)、幼龄期(10d)和成年期(A)3个阶段的新西兰白兔的肾、心和肝3种组织作为研究对象,按照RT-qPCR试验最低要求试验信息量(MIQE)的指导,运用RT-qPCR和在线内参基因稳定性评价工具RefFinder,比较6个常用的内参基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2 M、Sdha、β-actin)mRNA的表达稳定性。结果表明,新西兰白兔的肝和肾组织中的6个内参基因在3个发育阶段最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH,而在心组织中最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西兰白兔胚胎期的3种组织中,最稳定的3个内参基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1,而在幼龄期和成年期最稳定的3个内参基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。对新西兰白兔的3个发育阶段和3种组织的内参基因稳定性结果分析表明,最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究证实,新西兰白兔不同的发育时期和组织中,最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时,可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-qPCR数据的指标,以确保试验组个体间的差异最小,和小变量的准确数据分析。     

急性镉胁迫下草鱼肝胰脏中几个内参基因表达稳定性的比较研究

为筛选重金属镉胁迫下稳定性较好的内参基因,选择在镉胁迫下草鱼肝胰腺中4个候选内参基因18S核糖体RNA(18SRibosomal RNA,18SrRNA),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),β-肌动蛋白(beta actin,β-actin)和β微球蛋白(beta-2-microglobulin,β2m)进行分析。结果表明,geNorm软件分析得到18SrRNA和β2m的M值为0.716,稳定性最好;NormFinder软件分析得到GAPDH和18SrRNA稳定值分别为0.423和0.431,稳定性较好;BestKeeper软件分析得到18SrRNA标准差为0.28,稳定性最好。研究结果知,在研究重金属镉胁迫下草鱼肝胰脏基因表达情况时应选用18SrRNA为内参基因。     

羊草不同组织实时定量PCR内参基因的筛选

为筛选羊草(Leymus chinensis)不同组织实时定量PCR(qRT-PCR)试验体系中的最佳内参基因,以羊草叶、茎、根、穗为研究材料,利用qRT-PCR技术分析TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20共8个常用候选管家基因的表达情况,并使用geNorm和NormFinder软件进行综合评价,以期筛选出羊草不同组织中最稳定的内参基因。结果表明,8个候选内参基因在羊草不同组织表达稳定性不同,其中,叶片中稳定性较高的内参基因是Actin;茎中稳定性较高的内参基因是EF-1a;根中稳定性较高的内参基因是APRT和18SrRNA;穗中稳定性较高的内参基因是TUB。本研究结果将为开展羊草功能基因的表达分析提供重要参考。     

乳腺癌细胞(MCF-7)内参基因的选择

将稳定转染了真核表达载体pcDNA V5 HisB-rib-esp的乳腺癌细胞(MCF-7)和正常传代细胞分别于10%和20%胎牛血清(FBS)的DMEM条件下培养,连续传代3次以上。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测上述4种细胞样品中5种常用看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)RNA聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、β2微球蛋白(β2-M)、18S核糖体RNA(18SrRNA)的mRNA稳定表达情况,并使用geNorm程序对其稳定性进行评价确定需要的内参基因数目,以选择转染过程中表达最稳定的内参基因。结果表明,5种看家基因表达稳定度M值的排序为:RPⅡ=18SrRNA>β2-M>β-actin>GAPDH,需要2个内参基因(RPⅡ和18SrRNA)共同校正目的基因的表达。RPⅡ和β2-M分别是不同血清下和转染前后表达最稳定的内参。     

猪不同肉质样品内参蛋白表达情况研究

为了揭示猪不同肉质样品内参蛋白表达的稳定性,试验测定了北京黑猪宰后24小时pH值、肉色(L~*)值以及72小时滴水损失(drip loss,DL)值,并根据测定结果挑选出PSE(pale soft and exudative)及RFN(red firm and non-exudative)2种肉样,采用Western-blot方法检测2种肉样中3种内参蛋白β-Actin、Gapdh及β-Tubulin的表达情况。结果表明:3种内参蛋白在2种肉样中均能稳定表达,但与β-Tubulin相比,β-Actin和Gapdh的表达丰度更高。说明β-Actin、Gapdh及β-Tubulin均适合作为量化猪不同肉质样品蛋白表达的内参蛋白。     

脂多糖染毒小鼠稳定内参基因的筛选

本研究旨在筛选脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)染毒小鼠的理想内参基因。试验以健康小鼠肝脏和LPS染毒后3、6、12、18 h的小鼠肝脏为研究对象,荧光定量RT-PCR评价YWHAZ、HPRT1、PPIA、ACTB和18S rRNA 5个内参基因的表达情况,并用geNorm软件分析其表达的稳定性。结果表明,除18S rRNA在LPS染毒时不能稳定表达外,其余4个内参基因在健康小鼠肝脏和LPS染毒小鼠肝脏中均能稳定表达,其中PPIA和YWHAZ的表达最稳定。本试验结果为荧光定量RT-PCR研究LPS与小鼠相互作用时mRNA表达水平提供了依据。     

家兔矮小同源盒基因(Shox2)的克隆和表达分析

为了研究新西兰白兔矮小同源盒基因(Shox2)序列,预测其结构和功能,以及研究Shox2基因的时空表达特征,本研究克隆了新西兰白兔Shox2基因全长CDS区,分析其编码蛋白的同源性、亲疏水性、二级和三级结构特点、系统进化树等生物信息学特征,并用Western blot法验证融合蛋白TrxA-Shox2。分别在胚胎中期(E20.5d)、胚胎后期(E28.5d)、幼龄期(出生后10d)、成年期(A)4个时间点采集3只动物的肾、大血管、真皮、心、大脑、肝、肺、脾、肌肉、胆囊共10种组织,采用实时荧光定量PCR技术研究Shox2基因的时空表达图谱。结果,成功克隆了新西兰白兔Shox2基因(登录号:KP726285)。Shox2基因CDS区全长666bp,翻译221个氨基酸。生物信息学分析显示,Shox2为碱性、不稳定蛋白,Shox2蛋白氨基酸二级结构中α-螺旋区域占61.99%,无规则卷曲区域占33.48%,延伸链占4.52%。Western blot验证了融合蛋白TrxA-Shox2的表达。家兔Shox2蛋白氨基酸序列与眼镜猴、猩猩、褐家鼠、人的氨基酸序列同源性较高,说明Shox2蛋白在进化中较保守。Shox2基因mRNA在很多器官都有表达,在E20.5d的家兔胚胎中,Shox2mRNA在肾、肌肉和胆囊的表达量高,在E28.5d时表达量较高的是脾、心,幼龄期时表达量较高的是真皮、肝,成年期时表达量较高的是真皮、脾。本研究成功克隆了新西兰白兔Shox2基因,预测了其结构和功能。Shox2基因mRNA在很多器官都有表达,不同的组织和不同时间特征的表达量变化可能与Shox2功能高度相关,并受到严格的调控。     

部分地区奶牛腹泻粪便样中诺如病毒的检测和演化分析

牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)是一种引起犊牛腹泻的病原,目前已在19个国家检出。本研究旨在调查该病毒在国内部分地区的流行情况及分子特征。采用RT-PCR方法检测了5个省12个奶牛场的93份腹泻粪便样本和54份健康粪便样本。结果显示:腹泻样本中BNoV检出率为25.81%,极显著高于健康粪便样本中9.26%的检出率(P<0.01),证明该病毒与犊牛腹泻具有相关性;基于29个RdRp序列的遗传进化分析显示,5份样本为GIII.1型,24份样本为GIII.2型。对获得的18个VP1和13个VP2基因片段的遗传进化分析发现,中国的BNoV毒株具有独特的演化趋势。本研究证明BNoV已在国内的奶牛中广泛流行,是国内犊牛腹泻的新发病原,且国内的BNoV毒株具有独特的演化趋势,为犊牛腹泻的防控提供了重要参考。     

一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

检测纽布病毒的Real-time RT-PCR方法的建立与应用

纽布病毒(nebovirus, NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10~1～2.9×10~9copies·μL^-1之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL^-1;批内和批间的变异系数分别为0.89%～1.89%和0.83%～1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。     

牦牛源牛冠状病毒部分基因的扩增、序列分析及病毒分离鉴定

本试验的目的是对青藏高原地区牦牛进行牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的分子流行病学调查,并分离牦牛源BCoV。采用RT-PCR方法检测西藏、青海、四川、云南的犊牦牛腹泻粪便中BCoV,并扩增其S、HE及N基因片段;选取阳性样本进行BCoV分离。结果显示:从336份犊牦牛腹泻粪便中检出232份BCoV阳性,检出率为69.05%。序列分析和系统发育分析显示,本试验克隆的32个BCoV阳性样本中的S1亚基序列、HE基因片段和N基因片段均有独特的遗传进化趋势;首次成功分离到1株牦牛源BCoV,蚀斑纯化后病毒TCID50为10-7.17·0.1mL-1,鉴定结果显示该毒株S基因发生了重组事件。本试验结果表明青藏高原牦牛源BCoV感染率很高,且有独特的遗传进化趋势。     

一起猪非典型瘟病毒感染的诊断

2017年8月四川省某规模化猪场出现临产母猪产弱子、发抖、死胎,且死胎率达30%,哺乳仔猪成活率明显降低,其中以全身性或局部性阵发痉挛为典型症状。用RT-PCR扩增及序列分析确诊该猪场感染了一种新型的猪非典型瘟病毒(APPV)。这是四川省首次检测到并报道APPV,可为该病的研究和防控提供了一定的参考。     

全放牧与舍饲育肥对牦牛肉品质及安全性的影响

比较了全放牧饲养与舍饲育肥2种饲养方式对牦牛肉的理化性质、营养品质以及安全品质的影响,旨在为优质安全牦牛肉的生产和制定优质牦牛肉的评价标准提供理论依据。随机选择4头舍饲育肥100 d、平均体重(243. 00±21. 43) kg的麦洼公牦牛和6头全放牧饲养、平均体重(297. 17±65. 65) kg的麦洼公牦牛,屠宰后取背最长肌与后腿半腱肌,测定其理化性质、营养品质及卫生安全指标。结果:舍饲育肥牦牛肉的pH_(24 h)显著高于全放牧牦牛肉(P<0. 05)、蒸煮损失率和红度值(a*值)极显著低于全放牧牦牛肉(P<0. 01),而2种饲养方式牦牛肉的pH_(45 min)及滴水损失、亮度值(L*值)和黄度值(b*值)无显著差异(P>0. 05),饲养方式对牦牛肉干物质、粗蛋白和灰分含量的影响差异不显著(P>0. 05);背肌和腿肌2个部位牦牛肉的理化指标及营养指标均无显著差异(P>0. 05);在卫生安全指标方面,2种饲养方式牦牛肉中均未检出兽药残留以及重金属铬、镉和汞,挥发性盐基氮以及重金属砷和铅的含量均达到绿色食品标准。研究表明,舍饲牦牛肉与放牧牦牛肉的营养品质无差异;舍饲牦牛肉有更高的pH_(24 h)值和更低的蒸煮损失,是更为优质的牦牛肉产品;两种方式生产的牦牛肉均达到绿色食品标准,均为优质安全的畜产品。     

宏基因组学揭示AFB1对牦牛瘤胃微生物多样性及CAZy谱影响

采用宏基因组学方法探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)对牦牛瘤胃微生物多样性及碳水化合物酶类(CAZy)功能谱的影响。试验设E1、E2两个试验组和对照组C,日粮中添加AFB1量分别为20μg·kg^-1、60μg·kg^-1和0。采集瘤胃液,提取DNA,进行宏基因组分析。结果表明,AFB1降低拟杆菌门及厚壁菌门的丰度,在属水平上较高水平的AFB1对普雷沃氏菌具有抑制作用。牦牛瘤胃中降解植物纤维素主要的CAZy是糖苷水解酶(GH)和糖基转移酶(GT)。AFB1对CAZy中6类酶以及3种纤维小体构成组分均产生影响,且高水平影响更大。研究揭示,AFB1降低瘤胃细菌多样性,影响CAZy功能。研究结果有利于探讨AFB1影响反刍动物瘤胃微生态的机制,为饲料安全使用及牦牛健康养殖和产品安全生产提供参考。     

绵羊肺炎支原体恒温热隔绝式PCR方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体(Mo)感染疾病的现场便捷化诊断方法,本研究选择Mo高度保守区域tuf基因设计合成一对特异性引物和探针,建立了恒温热隔绝式PCR(iiPCR)方法并对其特异性、灵敏性进行评价。结果显示,建立的iiPCR方法仅对Mo的典型菌株和其临床分离菌株的DNA呈阳性结果,具有较强的特异性;对Mo基因组DNA的检出下限为24fg/μL,具有较高的敏感性。利用该方法检测临床样品,结果显示该方法可以从临床采集的羊鼻拭子及支气管拭子中检测出MoDNA,对扩增产物的测序表明检测结果具有较高的准确性。本研究建立的iiPCR方法为Mo的检测及其感染疾病的诊断提供了快速、便捷的技术手段。