番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系，为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系（embryogenic cell suspensions,ECS）为遗传转化受体，利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化，对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索，最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理，观察ECS细胞状态，筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L-1和5 mg·L-1。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养，继代周期为14 d。经GUS染色验证，表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养，2个月后可获得大量球形体细胞胚，且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养，2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后，可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色，均可染成蓝色。抗性再生芽...     

胡萝卜筛选标记选择及遗传转化

以常用的筛选剂潮霉素(Hyg)、除草剂Basta和卡那霉素(Kan)对胡萝卜愈伤组织进行敏感性试验,结果表明:胡萝卜愈伤组织对潮霉素和除草剂Basta非常敏感,筛选浓度分别以8mg/L和2mg/L较为合适;卡那霉素合适的筛选浓度应为150mg/L.以带bar基因的质粒载体对胡萝卜愈伤组织进行遗传转化,获得抗性愈伤组织和再生植株.     

八棱海棠高效再生体系的建立及潮霉素的抗性试验

以八棱海棠子叶为外植体,比较了不同浓度植物激素、不同激素组合、不同暗培养时间及不同浓度潮霉素对八棱海棠再生体系的影响,建立了八棱海棠高效再生体系,筛选并分析了潮霉素在八棱海棠遗传转化中的适宜浓度。结果表明:诱导子叶愈伤的最佳培养基为Sc+2.0 mg·L~(-1) TDZ+0.2 mg·L~(-1) NAA+0.5 mg·L~(-1) GA_3,芽再生的最佳培养基为Sc+2.0 mg·L~(-1) TDZ+0.2 mg·L~(-1) NAA,暗培养最佳时间为10 d,生根最佳培养基为1/2MS+0.25 mg·L~(-1) IBA。八棱海棠在整个再生过程中均对潮霉素敏感,在潮霉素浓度为2.0 mg·L~(-1)的愈伤诱导培养基上,外植体的愈伤诱导率仅为23.33%,分化率仅为9.88%;当潮霉素浓度为4.0 mg·L~(-1)时,愈伤诱导率下降为13.00%,而且愈伤不分化,随着培养时间延长,愈伤组织变得更加致密,之后变褐死亡。在诱导生根培养基上添加3.0 mg·L~(-1)潮霉素,生根率仅为3.52%,大部分外植体再生芽底部只会诱导出愈伤组织,没有根原基形成。八棱海棠子叶愈伤诱导及分化的潮霉素筛选临界浓度为2.0～4.0 mg·L~(-1),生根时潮霉素筛选浓度为2.0～3.0 mg·L~(-1)。     

东方百合高效转基因体系构建及EPSP基因的导入

以东方百合‘西伯利亚’无菌鳞茎超薄切片(0.5～1.0 mm)为试材，通过PIC和2,4-D不同浓度筛选愈伤诱导培养条件，采用超薄鳞片直接分化及愈伤分化2种转化方式，测试对Cef、Kan及Hgy的耐受性，分析不同干燥预处理以及MES、AS对转化效果的影响，并通过EPSP基因的导入，验证基因转化阳性率及转化效果，以期优化百合遗传转化的技术参数，建立高效遗传转化体系并进行EPSP基因的导入。结果表明：PIC对百合愈伤诱导有良好效果，MS+1 mg·L^-1 PIC+0.3 mg·L^-1 NAA为最佳愈伤诱导培养基；抗生素敏感性测试发现，培养基添加75 mg·L^-1 Kan或20 mg·L^-1 Hyg结合250 mg·L^-1 Cef适宜抗性筛选；超薄鳞片及愈伤在60 min和30 min的干燥预培养下，阳性率均显著提高；MS+10 mmol·L^-1 MES+200μmol·L^-1 AS为重悬液处理，超薄鳞片获得48.3%的高效转化率，优于愈伤...     

甘蔗品种ROC22组织培养体系中G418的浓度筛选

以甘蔗品种ROC22茎尖组织为材料,在组织培养的各个阶段,设定添加G418的浓度梯度进行筛选,找出甘蔗品种ROC22遗传转化体系建立的组织培养每个阶段最佳的G418浓度,为应用遗传转化改良甘蔗品种提供参考依据.研究发现,甘蔗品种ROC22茎尖愈伤组织生长、分化、小苗生根阶段的最佳G418浓度分别为20 mg/L、40mg/L、30mg/L.≤20mg/L浓度的G418能促进甘蔗分化,当G418达到一定浓度甘蔗不能生长,因此G418可用于筛选带有其抗性的植株.     

橙色大白菜遗传转化体系的初步建立

以06J28橙色大白菜子叶段为外植体,通过根癌农杆菌介导CMS7311-orf224基因,探讨了潮霉素、头孢霉素、预培养时间、农杆菌浓度、感菌时间和共培养时间等因素对橙色大白菜遗传转化的影响.试验结果表明,子叶段预培养2~3 d后,在OD600值为0.3~0.5的农杆菌EHA-105菌液中侵染5 min,再共培养2~3 d,在培养基中加入5 mg/L Hyg (抗性筛选)和500 mg/L Cef(脱菌)可得到转化植株.试验初步建立了橙色大白菜遗传转化体系,为大白菜种质资源创新奠定了基础.     

地被菊'映洁红菲'再生及遗传转化体系的建立

以地被菊'映洁红菲'试管苗叶片为试材,采用组织培养法,研究了6-苄基腺嘌呤、萘乙酸激素浓度、蔗糖浓度、MS浓度、NO3-和NH+的浓度比、羧苄青霉素浓度及潮霉素浓度对不定芽分化的影响,以期建立'映洁红菲'高效的再生体系,为地被菊转基因体系奠定基础.结果 表明:在6-BA和NAA浓度分别为2.0、0.6 mg·L-1,蔗糖浓度为30 g·L-1,NO3-:NH4+为30∶30,基本培养基3/4MS中,'映洁红菲'叶片中愈伤组织诱导和不定芽分化率达到最高,平均每个叶盘分化3.22个不定芽,诱导率75.67％.在生根培养基中加入浓度为0.75 mg·L-1 IBA时,根系生长最好.'映洁红菲'遗传转化时,羧苄青霉素浓度为250mg· L-1,潮霉素浓度为2.0 mg·L-1,适合作为选择压.     

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。     

番茄06P28子叶受体系统建立的研究

以番茄06P28为试材,对其子叶分化培养基及该材料对潮霉素和羧苄青霉素的天然耐性进行了研究.结果表明:适宜的分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L IAA 0.2 mg/L,潮霉素的筛选浓度和羧苄青霉素的抑菌浓度分别以10mg/L、35mg/L为宜.     

茄子遗传转化植株再生体系的优化

以4个茄子品种的下胚轴和子叶为外植体,通过不同外源激素种类和浓度组合筛选,对茄子遗传转化过程中外植体脱分化诱导、植株再生及生根培养基进行优化,探索建立较为通用完善的茄子遗传转化植株再生体系。结果表明,茄子下胚轴的再生能力要显著高于子叶,不同茄子品种间的分化能力差异明显;最佳愈伤诱导培养基为MS+ZT 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L,最佳植株再生分化培养基为MS+ZT 0.5 mg/L,最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。     

茄子子叶下胚轴离体再生体系建立

以3份茄子材料无菌苗子叶和下胚轴为外植体,研究其在MS附加不同浓度6-BA和NAA的培养基上的分化情况.结果表明:在不同培养基上,茄子子叶和下胚轴均能诱导出愈伤组织和分化形成不定芽,但不定芽诱导率存在明显差别,诱导3份材料下胚轴愈伤组织形成和芽分化的最佳培养基均为:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L,子叶因品种不同有较大差异,紫色长棒茄芽分化最佳生长调节物质组合是6-BA 1.0 mg/L-+NAA 0.5 mg/L;紫红线茄是6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;紫黑短棒茄是6-BA 3.0 mg/L-+NAA 0.5 mg/L.     

高品质甜叶菊品系“1096”的组培快繁

采用改良DNS等方法筛选出的生长快、糖苷含量高的甜叶菊品系＂1096＂为材料,研究了不同外植体、不同激素种类和配比对愈伤组织诱导、不定芽分化和生根的影响。结果表明：以茎尖为外植体愈伤组织和不定芽诱导率均最高;其次是带腋芽茎段;再次为叶片。无腋芽茎段和无菌根均能诱导出愈伤组织,但不能诱导成芽。茎尖不定芽诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.0mg/L;叶片不定芽诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.0mg/L＋IAA 1.0mg/L;带腋芽茎段不定芽诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.5mg/L。不定芽继代增殖培养采用MS＋6-BA 0.5mg/L＋NAA0.05mg/L;在1/4MS＋IBA 0.1mg/L＋NAA 0.1mg/L＋1g/L活性炭的培养基上诱导生根,生根率可达100%,生根苗移栽后成活率达95%。     

红掌愈伤组织增殖分化条件的优化

以红掌愈伤组织为材料,研究影响红掌愈伤组织增殖和分化以及芽增殖的因素。结果表明:以MS+6-BA1.0 mg/L+KT 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L为红掌愈伤组织增殖和分化的最佳培养基,培养到8周绝对生长速度达到910.31%、分化率达到100%,到150 d时分化指数达到24.17;在芽增殖培养试验中,以1/2 MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂8 g/L为适宜培养基。在培养方式上,液体培养优于固体培养。     

菊苣组织培养及植株再生

以普那菊苣叶柄为外植体进行组织培养试验,结果表明:菊苣叶柄在5种培养基上均可诱导出愈伤组织,总出愈率在90%以上,但分化效果因培养基的不同而有较大的差异.诱导愈伤组织及分化的最佳培养基为:MS KT 1.0 mg/L十NAA 0.2 mg/L;生根培养基为:MS IBA 0.2 mg/L.     

噻重氮苯基脲对文冠果愈伤组织诱导与分化的影响

以文冠果茎段和幼嫩叶片为外植体,分别进行了茎段和幼嫩叶片的组织培养试验,研究了附加不同浓度的噻重氮苯基脲(TDZ)愈伤组织和不定芽分化的影响。结果表明:MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L培养基对幼叶的诱导分化培养效果最好;MS+TDZ 0.02 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L培养基对茎段诱导不定芽的效果最好;而TDZ在文冠果生根培养中不起作用。     

圆叶椒草的组织培养与植株再生研究

以圆叶椒草茎段为试材,采用植物组织培养方法,研究了6-BA、NAA、IBA对圆叶椒草的愈伤组织诱导、不定芽分化以及试管苗生根培养的影响,以期筛选出愈伤组织和芽分化以及生根诱导的最佳培养基.结果表明:愈伤组织诱导、愈伤组织和不定芽分化最理想的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L;试管苗生根培养最佳培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+0.5％活性炭.     

非洲菊组织培养中La3+的应用初探

 以非洲菊‘Sunbird’品种的花托、幼叶、幼芽为外植体, 研究不同浓度La³⁺对愈伤组织形成、生长、幼芽分化增殖的影响。结果表明, 低浓度La³⁺对花托愈伤组织形成、生长及芽的分化有促进作用,最佳处理浓度为10 mg/L , 处理浓度大于10 mg/L 时抑制芽的分化, 并明显引起褐化。La³⁺对离体叶片愈伤组织形成生长的促进作用亦随处理浓度的提高而增大, 但愈伤组织的褐化率也增大, 最佳处理浓度为15 mg/L。幼芽的增殖系数在La³⁺ 0～50 mg/L 范围内随浓度的提高而增大, 50 mg/L 时最大, 达20. 8 , 但浓度大于30 mg/L 时增殖过程易出现玻璃化苗并引起叶畸形, 增殖的最佳浓度为30 mg/L。     

薰衣草叶片高频再生体系的建立

 以薰衣草叶片为外植体进行了离体再生研究。结果表明: 叶片愈伤组织诱导最佳的培养基是MS + 2,4-D 0.1 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L, 诱导率高达100%; 液体悬浮—固体培养芽分化率达92.5% , 芽数/愈伤组织达6.6; 正交试验筛选出芽增殖最佳培养基为MS +NAA 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + IAA 1.0 mg/L, 其增殖系数高达8.7; 在芽增殖培养基上可直接生根, 生根率达100%。     

金钻蔓绿绒组培再生体系的建立

以金钻蔓绿绒幼苗茎段为外植体,进行愈伤组织诱导、不定芽分化及增殖培养的研究。结果表明:金钻蔓绿绒茎段在MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.1mg/L培养基可成功诱导出愈伤组织,继而分化出不定芽;不定芽适宜增殖培养基为MS+6-BA 6.0mg/L+NAA 0.2mg/L,增殖倍数可达3.93;不定芽适宜的生根培养基为1/2MS+NAA 1.0mg/L,生根率可达100%,移栽30d后成活率达95%以上。     

白花紫露草的组织培养与植株再生体系的建立

以白花紫露草嫩茎为材料,进行了愈伤组织诱导、分化、试管苗生根、试管苗移栽所需条件的研究。结果表明：1/2MS＋BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L是诱导愈伤组织的理想培养基;MS＋BA 1.0 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L是诱导愈伤组织形成,同时具有分化能力愈伤组织的理想培养基;1/2MS＋BA 0.2 mg/L＋NAA 0.1 mg/L是诱导愈伤组织和不定芽分化的理想培养基;1/2MS＋IAA 0.3 mg/L是生根培养的理想培养基;以炉灰渣为试管苗的移栽扦插基质,移栽成活率为98%,扦插成活率为91%。