重组猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化

干扰素(IFN)自1957年首次被发现,因其具有高效广谱的抗病毒活性而备受关注.目前,IFN也是动物体中所知作用最快的第一防御体系,多个物种的IFN已得到深入的研究,但对猪IFN的研究相对较少.猪IFN-α在抑制口蹄疫病毒活力方面具有明显的作用,因而研究具有广谱抗病毒效应的猪IFN具有重要意义.     

重组猪α干扰素在仔猪腹泻疾病防控中的应用

为研究重组猪α干扰素(IFN-α)对仔猪腹泻疾病的防控效果,分别在2个猪场对腹泻仔猪进行重组猪IFN-α治疗试验。试验猪场1为猪伪狂犬病野毒感染场,仔猪1日龄腹泻发病率约60%,4日龄腹泻发病率约30%;试验1组,仔猪1日龄滴鼻接种猪伪狂犬病疫苗SA215株,4日龄仔猪腹泻发病率降低至11.8%,比对照组低18.3个百分点;试验2组,仔猪1日龄滴鼻接种猪伪狂犬病疫苗SA215株,母猪与仔猪连续3 d肌肉注射重组猪IFN-α,4日龄仔猪腹泻率降低至2.2%,比对照组低27.9个百分点;试验3组,母猪与仔猪连续3 d肌肉注射重组猪IFN-α,4日龄仔猪腹泻率为6.3%,比对照组低23.8个百分点。试验猪场2,仔猪1日龄腹泻发病率50%左右,4日龄仔猪腹泻率为28.7%;重组猪IFN-α治疗试验组,4日龄仔猪腹泻率降低至9.6%,比对照组低19.1个百分点。母猪与仔猪连续3 d肌肉注射重组猪IFN-α,能够有效降低仔猪腹泻发病率。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

乳糖诱导重组鸡γ干扰素基因在大肠杆菌中的表达

本文考察了乳糖代替IPTG诱导鸡γ干扰素(ChIFN-γ)在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。分别对乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式等方面进行了分析,并在最优诱导条件下与IPTG诱导进行比较。结果表明,工程菌在对数生长中后期(OD600为1.5)添加终浓度为2g/L的乳糖诱导7h对蛋白的表达和菌体量最为有利。由于乳糖本身可作为碳源被菌体利用,分批流加乳糖效果优于一次性添加。与IPTG诱导相比,乳糖诱导的蛋白表达量为29.8%,稍低于IPTG的32.3%,诱导后蛋白表达时间也有所滞后,但收获的菌体量则显著高于IPTG诱导,约为1.21倍,显示出了乳糖作为诱导剂的自身的优势。研究结果证明乳糖可以作为诱导剂应用于重组鸡γ干扰素的工业化生产,同时也为其它重组基因工程药物的生产提供了有益的参考和借鉴。     

重组猪α干扰素的临床研究

猪繁殖与呼吸综合征具有较高的病死率,需要对该病进行有效的防控与治疗,其中重组猪α干扰素有着显著的治疗效果,能够对变异的猪繁殖与呼吸综合征病毒进行有效的预防与治疗.本文的研究对象为病猪共75头,研究时间为2020年6月～2021年6月期间,分析重组猪α干扰素提高猪繁殖与呼吸综合征的临床有效率.     

重组鹅IFN-α在大肠杆菌中的表达及抗血清制备

为了研究鹅α干扰素(goIFN-α)基因原核表达产物的反应原性并进行goIFN-α抗血清的制备,试验首先根据大肠杆菌偏爱密码子对goIFN-α基因进行优化,随后采用PCR方法扩增goIFN-α编码序列并进行同源性分析。将goIFN-α片段与表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot检测。通过切胶回收的方法回收目的条带,将碾碎的蛋白胶与PBS混合后注入小鼠体内,15 d后回收血清进行Western-blot检测。结果表明:试验成功扩增出goIFN-α基因;与多种IFN-α基因序列进行比较,goIFN-α基因氨基酸序列的同源性为92.5%～98.1%;随后成功构建出重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,重组蛋白goIFN-α的分子质量约为18 ku,具有良好的反应原性;回收血清进行Western-blot检测,鼠抗goIFN-α血清制备成功。说明重组goIFN-α蛋白能够在大肠杆菌中表达,大小符合预期且具有良好的反应原性,并成功制备出鼠抗goIFN-α血清。     

猪α-干扰素基因在大肠杆菌中的表达及活性测定

根据GenBank中登录号为M28623的基因序列,合成猪α-干扰素成熟肽基因,并将该基因克隆至pQE-31载体,转化宿主菌M15诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明该蛋白以包涵体形式表达,分子量约21 ku,经包涵体变性复性后获得了具有抗病毒活性的干扰素,用MDBK-VSV系统检测其抗病毒活性不低于1010 U/0.1 mL.     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

重组黑白花奶牛γ-干扰素在大肠杆菌中的原核表达与鉴定

根据黑白花奶牛γ-干扰素(BovIFN-γ)基因的序列,通过RT-PCR扩增出BovIFN-γcDNA,并将其定向插入原核表达质粒pET-30a(+)和pGEX-6P-1,经DNA测序后,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别表达出大小在23和43 ku左右的融合蛋白。通过对诱导剂的浓度、诱导起始时间、诱导持续时间的筛选,对表达条件进行了优化,BL21(DE3)/pET-30a(+)-BovIFN-γ与BL21/pGEX-6P-1-BovIFN-γ的融合蛋白的相对表达量最高时可分别达到菌体总蛋白的60%和45%左右。使用纯化的融合蛋白rHis-BovIFN-γ和rGST-BovIFN-γ进行细胞病变抑制试验,证实表达产物具有较高抗病毒感染活性,在牛肾细胞(MDBK)上抑制水疱性口炎病毒的活性分别为2.15×107和1.21×105U·mg-1。     

重组胸腺肽α1在大肠杆菌中的表达与免疫活性检测

根据大肠杆菌密码子偏嗜性修改、合成胸腺肽alpha 1（Tα1）基因并连接到pET32α（＋）中构建融合表达载体pET32α-Tα1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导,经15%SDS-PAGE检测,Tα1获得可溶性表达。将诱导表达菌高压均质破碎后进行亲和层析纯化,洗脱蛋白峰经脱盐处理后进行免疫活性测定。通过脾淋巴细胞转化试验测定纯化重组Tα1和人用Tα1的活性,结果显示,重组表达的Tα1具有明显的促进淋巴细胞增殖的活性;脱E受体法E玫瑰花环试验测定结果显示,制备的重组Tα1的E玫瑰花结百分率高于空白对照组14.3%以上（胸腺肽溶液的质量标准为提高10%）,能够明显增强T细胞的活性。     

重组猪α干扰素防治猪腹泻

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,是临床上导致猪腹泻的重要病毒. 该病不同年龄、性别和品种的猪均易感,其中仔猪的感染率、发病率、死亡率最高,其临床症状主要为腹泻、呕吐和脱水.     

猪白细胞干扰素和重组猪α干扰素的区别

1957年,Isaccs和Lindenmann将灭活的流感病毒处理过的鸡胚绒毛尿囊膜块置于37℃震荡培养后,发现在其培养液中出现了一种能明显干扰和抑制流感病毒和仙台病毒复制的可溶性细胞分泌物     

卵黄抗体在防治仔猪大肠杆菌病中的应用

利用外源特异性卵黄抗体防治猪产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)感染是近年来人们关注的一个热点。重点简述卵黄抗体的特性、防治仔猪大肠杆菌感染的作用机理及应用效果。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

重组家禽干扰素在家禽疾病防制中的应用效果

干扰素（Interferon，IFN）是由英国科学家Alick Isaacs和Jean Lindemann于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的。它是细胞受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受体细胞分泌的糖蛋白。这种具有高度生物学活性的糖蛋白能够干扰病毒的繁殖，称之为干扰素。干扰素被发现时，人们以为其抗病毒活性为其唯一特性，随着研究的不断深入，人们逐渐发现IFN除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节、抗肿瘤等生物学功能。     

重组人γ－干扰素纯化工艺的建立

采用超声破碎的方法提取hIFN-γ包涵体,经盐酸胍溶解、稀释复性、浓缩后通过SPSepharose F.F层析纯化,简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。SDS-PAGE检测表明,hIFN-γ纯度达97%,比活性为3.5×107IU/mg,总回收率达40%。说明整个工艺适合于大规模生产的要求,具有实际应用价值,为hIFN-γ批量生产奠定了良好的基础。     

重组猪α干扰素冻干保护剂的筛选

为使重组猪仪干扰素（rPoIFN—α）制品更好地应用于生产实践中,采用保守的冻干工艺重点对rPoIFN-α制品的冻干保护剂进行筛选,通过外观检测、水分含量、活性检测对14种冻干保护剂进行了比较和筛选。研究结果表明,终浓度2％、4％和5％的甘露醇的保护效果较好,活性保持率分别为102．8％、95．1％、108．3％。按照活性好的这三个配方再冻干三批制品进行放置40℃加速稳定性实验。结果表明,在40℃放置三个月后,三个保护剂制品效价基本没变化,稳定性良好,有效期暂定为两年。本研究初步探索了rPoIFN一仪的冻干配方,为rPoIFN-α的产业化打下了基础。     

重组猪α干扰素的聚乙二醇修饰研究

采用分子量为20 k D单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(m PEG-SC)修饰重组猪α干扰素,初步研究了修饰反应条件及分离纯化工艺。结果表明,单修饰PEG-IFNα的转化率达到65%,单修饰产品纯度达到97%。由于修饰产物相对分子质量和不均一性的增加,导致其体外杭病毒活性降低,抗病毒活性保留达到未修饰重组猪α干扰素的29%,仍然具有良好的抗病毒作用。