一种高效提取棉花细胞核的技术

1材料与方法1．1材料二倍体亚洲棉品种石系亚1号,来自中国农业科学院棉花研究所。试剂HEPES购自Amresco公司,DTY购自BioBasicInc．,TritonX-100、PVP40购自Sigma公司,DAPI购自Roche公司,其他试剂均为国产分析纯。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定

1材料与方法1．1材料酶和试剂：各种限制性内切酶购自Roche公司,T4DNA连接酶购自上海生工公司,Taq聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒均购自Promega公司,引物由上海生工公司合成,其他试剂均为进口或国产分析纯。植物材料和质粒：棉花洞A雄性可育株由西南大学棉花教研室提供,表达载体P^BП21质粒和大肠杆菌菌株XL1-Blue由西南大学生物技术中心实验室保存。pUCm-T克隆载体购自上海生工公司。     

外源蛋白定位马铃薯淀粉粒表达载体的构建

1材料与方法 1．1材料马铃薯品系：郑1011。受体菌：大肠杆菌BL21。载体质粒pCambia1305—1购自TaKaRa公司;反转录试剂、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司;DNA回收试剂盒Wizard PCR preps DNA Purification System购自Promega公司。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

1材料与方法 1．1材料 供试鲤鱼购自成都市洗面桥市场。主要试剂：TR—Iaol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司,反转录试剂盒、pMD-18T载体、D12000DNA和如DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司;DEPC原液（Sigma分装）、JM-109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司,其他试剂均为国产分析纯。     

家蚕人工授精关键技术的研究

1材料与方法 1．1材料家蚕品种为菁松、皓月,由该研究室提供;解剖镜为OLYMPUS SZ51;精子细胞采集所用器材均为自制。Penicillin—Streptomycin和胰蛋白酶购自Invitrogen公司。TC-100培养基购自Sigma公司。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

1材料与方法1．1材料1．1．1取材。孕早期成年水牛子宫由南宁某屠宰场提供。1．1．2试剂。一次性细胞培养皿地幻自美同BD公司;新生牛血清购A杭州四季青公司;雌二醇购自宁波市激素制品有限公司;离糖型DMEM细胞培养液粉剂、DPBS粉剂和胶原酶I购自美因GIBCO公司;细胞角蛋白单抗和：二抗购白广州深达生物制品公司。另外,青霉素、链霉素、胰蛋门酶、表皮生氐因子（EGF）、     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

1材料与方法 1．1材料限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、PvuII、SspI、质粒抽提试剂盒、EcoT14 DNAMarker购自TakaRa公司。T4DNA连接酶购于promega公司。大肠杆菌DH5α菌株由该实验室保存。siRNA表达载体pSilencer 4．1-CMV Nero质粒购自Ambion公司。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

1材料与方法 1．1材料随机采集五指山猪品种耳组织样共30份,将其迅速放入液氮带回实验室,-70℃保存备用。 1．2试剂RT—PCRKit、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒,均购自天根生物工程有限公司;SalⅠ、BamHⅠ、pMD18-TVector试剂盒、Ecoli DH5α均购自TaKaRa公司。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。     

利用Asia 1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法(英文)

Using the purified VP1 protein of Asia 1 type foot-and-mouth disease virus as the antigen, the purified monoclonal antibody was labeled by the sodium periodate method and the monoclonal antibody competitive ELISA was established in this study. Ten positive porcine foot-and-mouth disease serums and more than two hundreds negative serum were tested, and the results were the same as the background of samples. The sensitivity test and replicate test indicated that this method was stable and sensitive, which was suitable for monitoring Asia 1 type porcine foot-and-mouth disease virus antibody.     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原,采用过碘酸钠法标记纯化的单抗,建立了单抗竞争ELISA,检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清,试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明,该方法具有稳定和敏感等特性,适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定

1材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒与细胞。犬瘟热病毒（CDV）、狂犬病毒（RV）、犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬腺病毒（CAV）,非洲绿猴肾细胞（Vero）、犬肾细胞（MDCK）、猫肾细胞（F81）,犬瘟热病毒单克隆抗体CE3由军事医学科学院军事兽医研究所犬病研究中心提供。     

鸡新城疫病毒F基因片段的原核表达及其抗F蛋白单克隆抗体的制备

[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。     

抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定

[目的]建立利用单克隆抗体检测犬瘟热病毒的直接免疫荧光诊断方法。[方法]通过搅拌法,用异硫氰酸荧光素标记G蛋白纯化的抗犬瘟热病毒单抗CE3,对荧光抗体进行纯化、鉴定,并确定其最适工作浓度。对61份临床可疑犬瘟热病料进行直接免疫荧光检测。[结果]吸收试验、阻断试验和特异性试验结果显示,标记抗体具有高度的敏感性和特异性,与犬细小病毒（CPV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬腺病毒（CAV）、狂犬病毒（RV）无交叉反应,其最优化工作浓度为1：80。对临床可疑犬瘟热病料的阳性检出率是48％。[结论]该研究建立的直接免疫荧光方法具有快速、特异和简便的优点,对犬瘟热疾病的早期诊断具有重要意义。     

O型口蹄疫病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪O型口蹄疫病毒(FMDV)间接免疫荧光(IFA)检测方法,以猪抗O型口蹄疫病毒阳性血清为一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SPA蛋白(葡萄球菌蛋白A)为二抗,通过反应条件的优化,建立检测方法。结果表明,IFA最佳工作条件为,一抗最适稀释度为1∶50,FITC标记的二抗的最适稀释度为1∶800,最适孵育时间均为1h。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法只能检测O型FMDV,而A型、AsiaⅠFMDV型和猪水疱病病毒(SVDV)检测结果均为阴性。建立的检测O型FMDV抗原的IFA检测方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,可用于FMDV感染的实验室诊断及其在感染机体中的定位和动态分布研究。     

抗IBDV VP2单克隆抗体制备及其免疫学鉴定

采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒弱毒Gt株,并与Tj强毒株共同免疫BALB/c小鼠.利用淋巴细胞杂交瘤技术,取其脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合, 经过3次筛选克隆, 获得8株具有分泌抗IBDV抗体的杂交瘤细胞系,并对8株单抗进行了分子生物学及免疫学方面的鉴定.间接ELISA显示获得的8株单抗只与IBDV有特异性的反应,Western-blotting表明,部分单抗能够特异地与Sf9细胞表达的VP2蛋白反应;中和试验表明8株单抗均具有中和活性,而且有3株中和效价在26以上.研究推测,8株单抗中有2株针对的表位为构象依赖性,其余6株单抗所针对的为线性中和性表位.     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

弓形虫重组GRA3抗原单克隆抗体的制备与鉴定

为了鉴定弓形虫特异性重组GRA3蛋白的抗原表位,以原核表达并纯化的融合蛋白GRA3免疫BALB/c小鼠,利用快速免疫法进行免疫,通过ELISA进行筛选,获得8株能够稳定分泌抗GRA3蛋白特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。这8株McAbs亚类鉴定均为IgG型,特异性强,ELISA检测结果均为阳性,抗体效价均大于1∶200 000。该结果为进一步探索GRA3蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。所生产的McAb可用于免疫组化和疫苗的制备,并可大大提高诊断的特异性。