姜曲海猪肺泡巨噬细胞的分离培养与鉴定

通过冷PBS气管灌洗法分离培养姜曲海猪肺泡巨噬细胞(PAM),进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测。从健康20日龄仔猪,分离得到PAM。以10%RPMI-1640培养液对PAM进行培养,观察细胞形态,用墨汁吞噬和免疫荧光检测了PAM的吞噬功能和纯度,比较冻存前和复苏后细胞的活率和细胞吞噬功能,以获得一批高纯度的PAM,用于猪体外呼吸道疾病发病机理的研究。     

猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究

通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测.结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P＜0.05);用70％ RPMI-1640+20％新生牛血清+10％ DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09％的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P＞0.05).     

穿心莲内酯对小鼠呼吸道免疫功能的影响术

通过给肺炎模型小鼠腹腔分别注射高剂量（200mg·kg^-1·d^-1）和低剂量（100mg·kg^-1·d^-1）的穿心莲内酯,7d后,测定小鼠免疫器官和肺泡灌洗液（BALF）中相关免疫指标的变化,探讨穿心莲内酯对呼吸道免疫功能的影响。结果表明,穿心莲内酯高剂量组小鼠的脾和胸腺指数、支气管肺泡灌洗液（BALF）中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）和干扰素-γ（IFN—γ）的含量均显著低于生理盐水组（p〈0．01）;而BALF中巨噬细胞吞噬率则显著升高（p〈0．01）。说明穿心莲内酯能增强巨噬细胞吞噬功能;并对脾、胸腺等免疫器官的生长,支气管sIgA分泌及IFN—γ表达有显著的降低,起到减缓或消退肺部炎症的作用。     

猪肺炎支原体的分离方法

为了寻求分离猪肺炎支原体更好的方法,本试验采用剪碎法、研磨法、匀浆法和灌洗法对猪肺组织进行处理,并研究了不同肺脏组织处理方法对猪肺炎支原体活力的影响。结果显示,剪碎法与灌洗法获得的处理液对猪肺炎支原体的影响小于研磨法与匀浆法。采用剪碎法、灌洗法和研磨法对100份猪肺组织进行猪肺炎支原体野毒株分离的结果显示,经PCR鉴定,剪碎法分离到1株猪肺炎支原体,分离率为1%;研磨法分离到7株猪肺炎支原体,分离率为7%;灌洗法分离到2株猪肺炎支原体,分离率为2%。以上结果表明,研磨法获得的组织处理液对支原体活力有一定的影响,但其分离率好于剪碎法和灌洗法。因此,研磨法是一种较好的猪肺炎支原体分离方法。     

体外定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

[目的]分离和克隆小鼠骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经元样细胞。[方法]利用Percoll密度梯度离心的方法进行小鼠骨髓间充质干细胞分离及培养,分别采用β-巯基乙醇和BHA诱导分化为神经元样细胞。用神经元特异性烯醇化酶和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学方法对已分化的神经元样细胞进行鉴定和分化率分析。[结果]经2种诱导剂诱导的小鼠骨髓间充质干细胞均出现神经元样细胞的分化,胞体呈神经元状,伸出较长轴突样和树突样突起且有分支。而且免疫细胞化学鉴定显示,诱导分化后的神经元样细胞神经元特异性烯醇化酶染色和神经纤维丝蛋白免疫细胞化学染色均呈阳性,β-巯基乙醇诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（86.8±2.7）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（75.2±2.3）%;BHA诱导分化细胞表达NSE的阳性率为（80.5±2.2）%;诱导分化细胞表达Neurofilament200 kD的阳性率为（73.2±1.6）%。[结论]小鼠骨髓间充质干细胞能够在诱导剂β-巯基乙醇和BNA的诱导下体外诱导分化为神经元样细胞。     

皮质醇对黄颡鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响

用Percoll连续密度梯度离心法分离黄颡鱼头肾巨噬细胞,经含0.1%牛血清的L-15培养液中培养,在光镜和电镜下观察其形态、超微结构和吞噬作用;采用硝基四氮唑蓝（NBT）与多孔酶标仪检测细胞在佛波豆蔻酸乙酯（PMA）刺激下产生的呼吸爆发,并观察外源皮质醇对黄颡鱼体内外头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响。结果表明：每尾黄颡鱼可分离出1.2-1.6 mL浓度为1×10^7cells/mL的高纯度头肾巨噬细胞;培养3-18 h后,贴壁纯化的头肾巨噬细胞达到95%-98%;分离培养的头肾巨噬细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,对福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌（F-SA）的吞噬率达95%以上。PMA刺激分离的头肾巨噬细胞产生显著的呼吸爆发活动。在较高浓度和较长作用时间情况下,外源皮质醇对黄颡鱼体内外头肾巨噬细胞的呼吸爆发均产生抑制作用。     

聚酰胺-胺对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

目的 研究聚酰胺-胺（poly-amidoamine,PAMAM）对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。方法 采用CCK-8试剂盒检测PAMAM对巨噬细胞的细胞毒性。通过巨噬细胞吞噬印度墨汁实验和吞噬鸡红细胞实验,观察PAMAM对巨噬细胞吞噬功能的影响。采用扫描电子显微镜（SEM）观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的形貌。结果 0.1-10 mg/mL的G5 PAMAM-NH2和10 mg/mL的G4.5 PAMAM-COOH对巨噬细胞有毒性（P<0.05）。0.01 mg/mL的G5 PAMAM-NH2、G4.5 PAMAM-COOH、G5 PAMAM-OH对巨噬细胞均无毒性（P>0.05）。0.01 mg/mL的PAMAM对巨噬细胞吞噬鸡红细胞形貌、吞噬率和吞噬指数均无影响（P>0.05）。结论 PAMAM的浓度在0.01 mg/mL范围内,未观察到其对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能有影响。     

奶牛腹腔巨噬细胞的分离与鉴定

以无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,分离获取奶牛腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,并通过瑞氏染色计算其纯度。结果表明,采用无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,能够获得较高纯度的巨噬细胞,能为奶牛胞内寄生菌存活机制的研究提供很好的试验材料。     

皮质醇对黄颡鱼腹腔炎性吞噬细胞的影响

炎症是免疫系统对感染的重要应答.以皮质醇混饲投喂的方法,模拟自然发生的应急反应,研究了应激激素皮质醇对黄颡鱼腹腔渗出炎症细胞的影响.结果表明:通过腹腔注射液体石蜡后诱导的黄颡鱼腹腔渗出炎症细胞主要包括嗜中粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性颗粒细胞(EGC).注射后2d,腹腔渗出细胞以嗜中性粒细胞为主(占嗜中粒细胞和巨噬细胞总数的61.5%±1.1%);注射后6d、10d则以巨噬细胞为主(在嗜中粒细胞、巨噬细胞和EGC分类计数中分别占77.8%±2.8%和82.3%±1.1%);注射后6d出现EGC,随后数量逐渐增加.炎症过程中腹腔渗出嗜中粒细胞和巨噬细胞对福尔马林灭活金黄色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率和硝基四氮唑蓝(NBT)反应阳性细胞率逐渐上升.皮质醇混饲投喂使腹腔渗出巨噬细胞比例和吞噬细胞的吞噬率在注射液体石蜡后6d时显著下降,而EGC比例显著上升.     

支原体检测及药敏分析在临床中的应用价值

目的：通过对支原体的检测及药敏情况来分析患者耐药程度,指导临床合理用药.方法用支原体（ Uu/Mh）分离培养药敏试剂盒对不同患者进行药物敏感性试验,并对其结果进行统计分析.结果250例患者的泌尿生殖道分泌物中分离支原体感染92例,标本阳性率为36.8%,其中解脲支原体（Uu）75例,阳性率为81.5%;人型支原体（Mh）3例,阳性率为3.2%;混合感染（Uu＋Mh）14例,阳性率为15.3%;药敏结果显示：支原体对12种抗生素中交沙霉素、多西环素、美满霉素和四环素的平均敏感率较高,分别为（93.02±7.15）%、（90.19±10.83）%、（86.03±14.30）%、（82.76±17.89）%,而对环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星和司巴沙星的敏感性较低;耐药性最强的抗生素是环丙沙星和左氧氟沙星.结论交沙霉素、多西环素、美满霉素和四环素可作为泌尿生殖道支原体感染的临床经验性选用的抗菌药物;支原体的培养及药敏试验可以掌握支原体的流行状况及耐药程度,为临床合理用药提供参考.     

奶水牛乳汁体细胞数与抗氧化指标的相关性分析

[目的]了解奶水牛乳汁体细胞计数（SCC）与抗氧化指标之间的相关性,为乳汁质量监控和奶水牛健康养殖提供科学依据.[方法]随机选取南宁某牛场奶水牛139头,同步采集乳样与血样,乳汁SCC采用FOSS体细胞仪测定,血浆和乳清的总抗氧化能力（TAC）采用FRAP法（血浆铁还原力法）测定,丙二醛（MDA）含量采用TBA法（硫酸巴比妥法）测定.[结果]被检的139头奶水牛中,乳汁SCC≥50.00万/mL（隐性乳房炎诊断标准）的样本占被检总数的12.23％,乳汁SCC＜50.00万/mL的样本占被检总数的87.77％;奶水牛血浆和乳清的TAC分别为2.44±1.04和3.78±1.68 U/mL,MDA含量分别为2.07±0.48和1.55±0.52 nmol/mL,其差异均达极显著水平（P＜0.01）.乳清TAC随乳汁SCC的升高而呈下降趋势,二者间呈显著负相关（r=-0.168,P＜0.05）;血浆MDA与乳清MDA间呈显著正相关（r=0.189,P＜0.05）,而血浆MDA与血浆TAC（r=0.391）、乳清MDA与血浆TAC（r=0.315）间呈极显著正相关（P＜0.01）.[结论]乳清TAC可作为检测奶水牛乳房健康及其乳汁质量的备选指标.     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

大鼠骨髓干细胞的分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的研究

目的探讨大鼠骨髓干细胞的体外分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的的可行性,并检测其表型和功能。方法取大鼠长骨骨髓细胞,第3代细胞传代后加用终质量浓度10μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）的细胞因子,培养3 d后行内皮细胞特异性成分鉴定。结果（1）免疫组化染色鉴定：P3代CD133呈中度阳性表现,CD34呈弱阳性表现;经VEGF诱导后表达明显增强。（2）流式细胞仪细胞计数鉴定：P3代CD133、CD34阳性细胞率分别为97.3%、55.5%;经VEGF诱导后CD133、CD34阳性细胞率分别为91.4%、78.6%。（3）P3代VEGF诱导后乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）、荆豆凝集素（UEA）双染鉴定：经VEGF诱导的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（70.2±5.1）%,未经VEGF诱导后的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（20.4±3.8）%。（4）RealTime-PCR检测第3代VEGF cell和三代cell的内皮细胞特异性成分表达：P3 VEGF cell血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）浓度是P3cell的2.22倍。结论用贴壁筛选法和VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的内皮祖细胞（EPCs）,该细胞具有内皮祖细胞的特性,可用于进一步向内皮细胞分化的研究与应用。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

1材料与方法1．1材料1．1．1取材。孕早期成年水牛子宫由南宁某屠宰场提供。1．1．2试剂。一次性细胞培养皿地幻自美同BD公司;新生牛血清购A杭州四季青公司;雌二醇购自宁波市激素制品有限公司;离糖型DMEM细胞培养液粉剂、DPBS粉剂和胶原酶I购自美因GIBCO公司;细胞角蛋白单抗和：二抗购白广州深达生物制品公司。另外,青霉素、链霉素、胰蛋门酶、表皮生氐因子（EGF）、     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

促性腺激素释放激素在不同品种水牛卵巢中的免疫组化定位

【目的】了解促性腺激释放激素（GnRH）在广西沼泽型水牛与摩拉杂交水牛卵巢中定位表达的异同点,为深入阐明GnRH调节卵巢功能的机制提供理论依据。【方法】采用免疫组化SP染色法对广西沼泽型水牛和摩拉杂交水牛卵巢中GnRH及其受体的分布表达进行对比研究。【结果】两种不同品种水牛卵巢中均存在大量的GnRH阳性细胞,且主要位于颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内;通过比较显示,两种不同品种水牛卵巢GnRH阳性细胞个数差异极显著（P〈0．01）,但GnRH阳性细胞大小及其平均光密度的差异均不显著（P〉0．05）。【结论】不同品种水牛卵巢的GnRH分布差异可能与繁殖性能有关,但主要分布于巢卵颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内。     

粒细胞集落刺激因子在羊成纤维细胞中的表达及对细胞增殖和凋亡的影响

【目的】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor,GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×10⁵个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL^-1 GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（P<0.01）;羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高（P<0.01）,试验组中的NFS-60的荧光强度与阳性对照组相比均差异不显著（P>0.05）,结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL^-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(15.99±0.38)%变为(15.39±0.60)%,差异不显著（P>0.05）;G2/M期细胞显著增多（P<0.05）,比例由(22.88±1.00)%增大到(26.76±0.82)%。表明在羊成纤维细胞中加入羊GCSF的24 h后,处于分裂状态和间期的细胞显著增多。48 h时,与对照组相比试验组G1期细胞比例由(65.96±0.37)%减少为(45.69±0.26)%,差异极显著（P<0.01）;S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著（P<0.01）;G2/M期细胞比例由(16.42±1.29)%变为(21.80±1.86)%,差异不显著（P>0.05）。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组（Ctr）和试验组（GCSF）的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著（P<0.01）,48 h检测时凋亡率差异不显著（P>0.05）,表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。     

村镇生活垃圾重金属含量及其土地利用中的环境风险分析

对全国12个省份72个典型村镇产生的生活垃圾进行采样调查,系统分析了我国村镇生活垃圾的重金属含量及其土地利用的环境风险。结果表明:我国典型村镇生活垃圾中重金属Hg、Pb、Cd、Cr、Cu和Zn的含量分别为(0.74±0.48)、(21.80±17.61)、(3.36±11.01)、(108.63±84.01)、(36.83±10.91)、(80.09±42.24)mg·kg~(-1);依据《城镇垃圾农用控制标准》,Hg、Pb、Cd、Cr的超标率分别是1.74%、3.44%、14.29%、2.09%。村镇生活垃圾土地利用的重金属环境风险评估表明:重金属单因子污染指数大小顺序为CdHgCrCuZnPb,其中Cd和Hg分别为重度和轻度污染;重金属内梅罗综合污染指数为4.08(重度污染),Cd和Hg的贡献最大;重金属潜在生态风险程度依次为CdHgCuPbCrZn,综合潜在生态风险等级为强生态危害。     

多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K+二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20+DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20+DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20+DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20+DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o