蝴蝶兰PhaSEP3基因的克隆及其在突变体中的表达

E类MADS-box是花器官发育分子模型中必不可少的基因,通过突变体研究其表达模式将为深入理解兰科植物花器官的分子机理与完善花发育调控理论提供依据。采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个E类MADS-box基因PhaSEP3(GenBank登录号为MZ436812),并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5种突变体中的表达水平。结果表明,该基因cDNA全长为1 236 bp,具有753 bp的开放阅读框(ORF),可编码250个氨基酸,其C端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序。系统进化分析显示,该基因编码蛋白质与蝴蝶兰属的PeSEP3和AGL9亲缘关系最近。组织特异表达分析表明,PhaSEP3基因主要在生殖器官和授粉后子房中表达;在不同突变体中,PhaSEP3基因在侧萼唇瓣化突变体的萼片和唇瓣中表达水平显著升高;在退化雄蕊瓣化突变体的侧瓣、唇瓣和子房中表达水平显著降低,在蕊柱中的表达水平显著升高;在侧瓣唇瓣化突变体的侧瓣和唇瓣中表达水平显著升高;在侧瓣退化突变体的侧瓣中表达水平显著降低,而在蕊柱和子房中表达水平显著升高;在侧瓣雄化突变体中,该基因的表达水平在萼片和侧瓣中均显著升高。分析认为,PhaSEP3基因主要调控蝴蝶兰花器官各轮组织与授粉后子房的发育,在突变体花器官中,PhaSEP3类基因可能与其他花发育基因互作参与花器官形态的发育调控。该研究结果为进一步理解兰科植物花器官多样性的调控机理提供了资料。     

辣椒花器官发育相关PAP3基因的克隆与生物信息学分析

AP3基因属于MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因,与PI基因一起参与控制植物花瓣和雄蕊的形成。克隆到了辣椒控制花器官发育的PAP3基因(Gen Bank登录号:HM104635),该基因全长929 bp,编码226个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域;与其他6种植物同源基因比对显示,它们的氨基酸序列相似性在82%~91%之间;系统进化树分析表明,PAP3属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚族成员,与辣椒花器官发育相关。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。     

枣SEP1基因的克隆和表达分析

SEP类基因属于E类MADS-box基因,在植物花器官发育中发挥重要作用。该研究以‘冬枣’为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术从枣中分离到1个SEPALLATA1基因,并进行生物信息学及转录表达分析。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框为735bp,编码244个氨基酸,预测分子量为27.9247kDa。系统进化树显示,该蛋白与其他植物SEP1类蛋白具有较高的同源性,命名为ZjSEP1(登录号为:KU375248)。实时荧光定量分析表明,ZjSEP1在枣不同组织中表达有显著差异,在蕾、花、幼果等生殖器官中高丰度表达,尤其是花发育前期表达最高;该基因在雄性不育和可育品种中表现出不同的表达模式,初步认为ZjSEP1基因可能在枣花器官的形成过程中发挥一定调控作用。     

野鸢尾PI-like基因的克隆及表达

为探究PI-like基因对野鸢尾花器官的花柱分枝和外轮花被片形成的作用,通过RACE方法,分离PI-like型花器官特征基因,并运用实时荧光定量PCR法检测其表达模式。结果表明:克隆得到野鸢尾2个PI-like基因,命名为Id PI1和Id PI2,其编码的氨基酸序列与MADS-box转录因子家族中的PI/GLO亚家族成员具有高度的同源性。Id PI1和Id PI2编码的氨基酸序列的同源性为80%。系统进化分析显示,Id PI1和IdPI2分布在进化树的两支,表明其功能可能发生了分化。相对定量检测结果显示,Id PI1和Id PI2的转录产物在花器官的各轮结构中均可检测到,但其表达量有差异。Id PI1在外轮花被片表达量相对较高,是内轮花被片的2.7倍,是花柱分枝的15倍;而Id PI2在外轮花被片、内轮花被片和花柱分枝的表达量差异不明显,外轮花被片是内轮花被片的1.4倍,是花柱分枝的2.7倍。2个Id PI基因对外轮花被片和内轮花被片的形成均有影响,且Id PI2对花柱分枝形成较Id PI1更为重要。     

莲NnFUL基因克隆、亚细胞定位及表达分析

为了研究MADS—box A类基因在莲花器官发育中的作用,以莲品种‘大洒锦'(Nelumbo nucifera‘Da sajin')的花蕾为试验材料,利用RT-PCR方法克隆了莲FUL-like基因cDNA序列,命名为NnFUL。NnFUL的cDNA长度为763 bp,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)共编码250个氨基酸。该蛋白属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成。系统进化分析表明:NnFUL编码的蛋白与AP1/SQUA亚家族中的FUL-like蛋白聚为一类,与二球悬铃木(Platanus×acerifolia)的FUL-like蛋白具有较高的亲缘关系。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。荧光定量Real-time PCR结果表明:NnFUL在花器官中表达量最高,主要集中在花萼和花瓣中,同时在营养器官中也有表达;因此,NnFUL在花器官发育尤其花萼和花瓣形成中有一定的调控作用。     

欧洲千里光SvAPETALA1基因的克隆及功能分析

【目的】花器官发育是影响花观赏价值的重要因素,AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用,旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。【方法】以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因,通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术,对SvAP1基因进行功能预测与分析。【结果】SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp,编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示：SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族,C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明：SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示：与野生型龙葵相比,转基因龙葵雌蕊发育异常,表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。【结论】欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育,与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异,即转...     

两种国兰MADS-box家族B类基因PI/GLO的克隆与时空表达特性分析

为了挖掘国兰PISTILLATA/GLOBOSA（PI/GLO）基因的功能,利用生物信息学方法对两种国兰PI/GLO进行鉴定分析,并利用实时荧光定量的方法对其表达模式进行分析。结果表明,所克隆的两个 PI/GLO均为MIKC型MADS-box基因,均有保守的MADS区和相对保守的K区,且与春兰（AD158461.1）同源性较高,分别为98%、99%。两个基因的登录号为：MW654194,MW654193。RT-qPCR试验分析得出, CfPI1 在蕙兰各组织器官中的相对表达丰度顺次为：花萼>花瓣>唇瓣>花蕾>子房>盛花期花葶>合蕊柱, CsPI1 在墨兰中的相对表达丰度顺次为：花瓣>唇瓣>花蕾>花萼>合蕊柱>子房。两个基因均在盛花期的表达远远高于花蕾期和营养生长期,且主要参与花器官的生长发育。     

中国水仙NtMADS3基因全长的克隆与表达分析

MADS-box基因在植物花发育中具有重要作用。采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙幼嫩花蕾中分离到了一个MADS-box同源基因,命名为NtMADS3(GenBank登记号:EU081900)。该基因cDNA全长980 bp;编码区编码241个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构。序列分析表明,NtMADS3编码的蛋白与其他植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与石刁柏的AOM3一致性高达89.2%,与拟南芥的AGL6一致性为60.0%。系统进化树分析表明NtMADS3基因属于E类功能基因。组织表达模式分析显示,NtMADS3基因在中国水仙的开花期各器官及花的各部位均有表达。将该基因置于CaMV 35S启动子控制下,构建到载体pBI121的多克隆位点,在拟南芥中异位表达,转基因植株花期提前,但花型无显著变化。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

两种模式酵母中可分解丙酮醛的GLO3的特性及鉴定

GLO3是一种不依赖辅助因子就可分解丙酮醛的酶,有研究表明大肠杆菌的EcHsp31和人的HsDJ 1均属于这种GLO3。丙酮醛是细胞糖酵解过程中产生的一种有毒的副产物,乙二醛酶Ⅰ(GLO1)和乙二醛酶Ⅱ(GLO2)在谷胱甘肽(GSH)的辅助下可以降解细胞内丙酮醛,乙二醛酶Ⅲ(GLO3)不需要GSH的辅助可以直接降解MG。研究真菌的GLO3降解丙酮醛的机制,对认识和研究因丙酮醛引起的疾病具有重要的指导意义。研究表明,真菌中GLO3同源蛋白十分复杂,Hsp31在真菌中广泛存在,DJ 1只在部分真菌中存在,进化树结果支持GLO3的同源蛋白Hsp31和DJ 1是一种趋同进化。对模式真菌酿酒酵母的ScHsp31和裂殖酵母SpDJ 1进行GLO3的酶活测定和HPLC产物检测表明,这两种蛋白均具有GLO3的特性。     

75K γ-黑麦碱基因的分子鉴定与转移

【目的】研究75K γ-黑麦碱基因的系统进化关系,并将秦岭黑麦75Kγ-黑麦碱基因导入普通小麦遗传背景中。【方法】利用75K γ-secalin亚基的特异引物secF/secR对5种黑麦进行扩增、克隆、测序及序列分析。以普通小麦(中国春)为母本,黑麦为父本,获得杂种。自杂种后代中,采SDS-PAGE技术分析杂交后代的75K γ-secalins蛋白亚基。用根尖制片进行体细胞染色体数目观察和原位杂交分析。【结果】序列分析结果表明,我国秦岭黑麦(AS156)与美国Wrens黑麦(CIse35)、土耳其4041黑麦(PI168199)、南非的Polko黑麦(PI412949)、智利278黑麦(PI436188)的栽培品系均具有75Kγ-黑麦碱典型的一级结构,但是在重复区中序列差异较大(包括缺失/插入和SNP)。聚类分析表明,我国的秦岭黑麦与同在北纬的土耳其和美国黑麦亲缘关系近,而与位于南纬的南非、智利的两种黑麦关系较远。以中国春为遗传背景,将位于秦岭黑麦2R染色体上的75Kγ-黑麦碱基因导入六倍体小麦,获得结实正常,农艺性状稳定的品系,编号WYQ122。通过SDS-PAGE技术和基因测序分析,已确认WYQ122中携带75Kγ-黑麦碱基因,同时原位杂交也验证黑麦染色体的存在。细胞学鉴定表明,WYQ122植株间染色体数目有41条和42条两种类型。【结论】黑麦的75Kγ-黑麦碱基因存在差异。以染色体代换系的方式将该基因转入普通小麦中。     

玉米PDI基因cDNA的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术,从玉米花丝中克隆得到了玉米蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因cDNA编码序列(GenBank登录号为EF532321)。生物信息学技术分析表明:该序列开放阅读框为1 542个碱基,编码513个氨基酸,组成的蛋白质分子式C2577H3980N648O771S11,分子量为56.7 kDa,等电点pI为5.01。基因进化树分析表明玉米中的PDI基因与水稻中的PDI基因具有较近的亲缘关系。亚细胞定位预测分析表明,该基因编码的蛋白定位于细胞的内质网。     

苦荞ARF基因家族的鉴定及生长素诱导下的表达模式

【目的】全基因组水平鉴定苦荞ARF家族基因,并对其家族基因结构、保守结构域、系统进化、组织表达差异及外源生长素处理下基因表达水平进行分析,为苦荞ARF的功能研究和利用奠定基础。【方法】通过转录组数据和ARF保守结构域（PF06507）分析,筛选苦荞ARF家族成员,利用TBtools软件绘制基因结构图,利用NCBI及MEME在线预测苦荞ARF蛋白保守结构域和保守基序,利用MEGA X构建苦荞和拟南芥、水稻、甜荞、甜菜、大豆ARF蛋白系统进化树。使用根、茎、叶、花、未成熟和成熟籽粒6个组织转录组数据的FPKM值,通过TBtools HeatMap绘制FtARFs基因表达热图,分析FtARFs的组织表达特异性。使用PlantCARE在线网站预测茎秆特异表达的FtARFs启动子的顺式作用元件。以0.5 mg·L ^-1 IAA处理2份高秆（ZNQ189和PI673849）与2份矮秆（PI658429和PI647612）苦荞材料,观察苦荞下胚轴伸长的特征,于生长素处理不同时间段（0、0.5、1、6、12、24和48 h）取样,qRT-PCR检测FtARFs基因在不同苦荞下胚轴中的表达差异;同时,对生长7 d的4份材料进行石蜡切片,番红固绿染色后显微镜下观察下胚轴细胞大小。【结果】系统分析鉴定了26个苦荞ARF家族基因,染色体定位分析显示,除第4染色体外,FtARFs在其余染色体均有分布。理化性质分析表明,氨基酸残基数目范围为331—1 083 aa,理论等电点为5.34—8.63。保守基序分析表明,不同组间Motif组成有一定的差异。基因结构分析显示,苦荞ARF基因外显子数量为2—15,变异较大。系统进化将其分成4组（Group Ⅰ—Group Ⅳ）,且苦荞FtARFs在4个类群中均有分布。组织特异性分析显示,在各组织中,FtARFs基因FPKM值差异明显,在根、茎、花中,分别检测到7个、9个和4个基因表达量较高,在叶、未成熟籽粒和成熟籽粒中,表达值均较低。外源生长素处理4份苦荞材料,下胚轴伸长趋势不一,与其细胞大小变化相一致。qRT-PCR结果显示,FtARFs基因在生长素处理前期（0.5—1 h）表达较高,在处理后期,基因表达量降低。且处理苦荞幼苗0.5 h时,大多数FtARFs基因被显著诱导表达。【结论】苦荞ARF基因结构和蛋白基序具有组间多样性和组内保守性,且具有组织表达特异性,9个茎秆特异表达的FtARFs基因响应IAA诱导,暗示其对苦荞茎秆伸长可能具有调控作用。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的异源表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏好性,在不改变编码蛋白的基础上,优化设计并合成枯草芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因,将其与大肠埃希菌 乳酸乳球菌穿梭质粒pAMJ399连接,构建重组质粒pAMJ399 PIPLC,并电转化至乳酸乳球菌中进行诱导表达。SDS PAGE分析显示：重组蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。重组蛋白在PI 李斯特氏菌显色平板上显现明显的乳白色晕圈,证明重组蛋白具有酶活性,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI PLC）在重组乳酸乳球菌中成功获得表达。通过优化培养条件,以2%转接量,在含有1%红霉素抗性的GM17液体培养基中,于32 ℃静止培养24 h,测得培养基上清液中PI PLC的浓度为1.092 μg·mL-1。     

鸭瘟病毒河南株gI基因的克隆与测序

参考GenBank中鸭瘟病毒gI基因序列设计并合成引物,以鸭瘟病毒河南分离株DNA为模板进行PCR扩增,将扩增片段克隆至PGEM-T载体上,得到含gI基因重组质粒。经酶切鉴定,并对重组阳性质粒进行序列测定。结果表明,获得的片段含鸭瘟病毒gI基因,全长1 089 bp,与已报道的其他疱疹病毒gI基因具有较高的同源性,编码432个氨基酸,蛋白分子质量为39.7ku、等电点(PI)为6.06。     

小麦高蛋白质含量基因GPC-B1的分子标记研究

应用SSR分子标记技术对4份来自美国的小麦研究材料的高蛋白含量基因GPC-B1进行分子标记分析。通过引物筛选和标记研究,其SSR分子标记为Xuhw89122。为鉴定其分子标记分析结果,对所有的小麦研究材料进行蛋白质含量的测定,来自美国的4份研究材料之一的PI638740的蛋白质含量高达20.41%,明显高于其他研究材料。田间观察结果显示,PI638740的成熟期比别的研究材料提前衰老一周左右。本研究将为转移控制小麦高蛋白质含量的基因到其他优良小麦品种(品系)中、推进小麦育种进程及改进小麦育种技术提供理论依据。     

Inheritance of Resistance to SMV3 and Identification of RAPD Marker Linked to the Resistant Gene in Soybean

One SMV resistant soybean line (95-5383) was crossed with four susceptible soybean varieties/line ( HB1, Tiefeng21, Amsoy, Williams) and one resistant introduced line PI486355. Their F1 and F2individuals were identified for SMV resistance by inoculation with SMV3. The results showed that in the four crosses of resistant × susceptible, F1 were susceptible and the ratio of F2 populations was 1 resistant : 3susceptible (mosaic and necrosis), indicating that 95-5383 carries one recessive gene that confer resistance to SMV3. There is segregation of susceptibility in F2 progenies from the cross of 95-5383 × PI486355, indicating that the SMV3 resistant gene in 95-5383 is located at different locus from PI486355. By bulked segregating analysis (BSA) in F2 populations of 95-5383 × HB1, one codominant RAPD marker OPN11980/1070 closely linked to SMV3 resistance gene amplified with RAPD primer OPN11 was identified. The DNA fragment OPN11980 was amplified in resistant parent 95-5383 and resistant bulk, and OPN111070 was amplified in susceptible parent HB1 and susceptible bulk. OPN11980/1070 was amplified in F1. Identification of the markers in F2 plants showed that the codominant marker OPN11980/1070 is closely linked to the SMV resistance locus in95-5383, with genetic distance of 2.1cM.