转TGEV-S基因玉米中目的基因的PCR检测及优化

为提高转基因玉米中目的基因的检出效率,以猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白（TGEV-S）转基因玉米为材料,利用PCR方法检测样品中的目的基因.通过对PCR反应体系中4种不同DNA聚合酶和8种退火温度进行比较,建立和优化了转基因玉米中TGEV-S基因的PCR检测方法.对450株转基因玉米叶片DNA和种子DNA中的TGEV-S基因片段进行检测,并设计33对引物检测插入转基因玉米基因组DNA中的质粒pBAC9020DNA片段.结果显示,LA Taq酶对叶片DNA和种子DNA中TGEV-S片段的PCR扩增敏感性和特异性均优于其他Taq聚合酶,且退火温度为53～55℃时扩增效果较好.分别对450份转基因玉米叶片DNA和种子DNA检测结果显示阳性率分别为82.5％和76.3％.利用33对引物进行的PCR扩增及测序结果显示质粒pBAC9020基因片段已全部插入该玉米基因组DNA中.本试验建立的转TGEV-S基因玉米PCR检测方法敏感性和特异性高,为转基因玉米阳性植株的检测奠定了坚实的基础.     

利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36的初步研究

通过优化PCR扩增体系,利用长片段PCR技术扩增全长稻瘟病抗性基因Pi36。结果表明,利用扩增长片段的LA Taq酶,结合使用GC buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增,在退火温度为62℃和62.8℃时,得到了扩增效率较高,特异性高的16.5kb目标带。     

7对猪源性成分检测相关引物的特异性评测

为了评测物种鉴定PCR体系的特异性及其影响因素,实验对猪源性成分鉴定相关的7对引物就退火温度、镁离子浓度和不同Taq酶的影响进行了研究。结果表明,退火温度和镁离子浓度对PCR特异性有着重要影响,而其中2对引物优化后仍与鼠、兔、牛、羊、鸡和鸭有非特异性扩增。不同的Taq酶对引物特异性也有重要影响,本实验中r Taq酶在7对引物PCR体系中特异性最佳。通过对引物体系的优化和选择不同的Taq酶,可以有效提高特异性,减少非特异性扩增,为建立物种鉴定的PCR体系及多重PCR提供了基础。     

一种采用阴离子交换柱快速纯化Taq DNA聚合酶的方法

通过37℃恒温振荡培养含有Taq DNA聚合酶基因的E.coli菌株,并用IPTG诱导该基因表达获得TaqDNA聚合酶蛋白,利用40％硫酸铵沉淀该蛋白后溶解于storage buffer中.此法获得的Taq DNA聚合酶带负电荷,因此采用阴离子交换柱纯化蛋白.试验结果表明,此法与传统的透析方法相比能快速地去除生物小分子杂质,同时去除透析方法无法除去的杂蛋白;既能保证Taq DNA聚合酶的生物学活性,同时能缩短纯化时间、提高Taq DNA聚合酶的纯度.以土壤微生物DNA、水稻cDNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行测序,结果显示纯化后的Taq DNA聚合酶具有较高的扩增效率和保真性.     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

棕榈科植物SSR分子标记反应体系的建立

以棕榈科植物的DNA为材料,通过对SSR反应体系中模板DNA、dNTPs、引物、Taq聚合酶和MgCl25个因素采用单因素试验法设定5个梯度,并比较不同的浓度、不同的用量对扩增效果的影响,建立最佳反应体系。研究最终确定了20μL PCR反应体系的最佳条件为:模板DNA 2μL,dNTPs 0.2μL,引物1.0μL,Taq聚合酶0.2μL,MgCl22.0μL。该优化体系稳定可靠,适合应用于棕榈科植物SSR分析。     

应用DPO技术检测番茄斑萎病毒方法的建立

为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术,以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因,设计了一对DPO引物,对PCR反应体系中的引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化,建立了TSWV的DPO-PCR检测方法,并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明,应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带,与预期目标相符。经过优化后,DPO-PCR反应体系(25μL)为:DNA模板1μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,d NTPs(每种2.5 mmol/L)2.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL,上、下游DPO引物(20μmol/L)各1.0μL,以去离子水补充至25μL。利用该检测方法,在49.8~70.0℃的退火温度范围内,均可实现目标基因片段的高效扩增,说明其对退火温度不敏感;利用病毒RNA进行检测,该方法的灵敏度为7.5 ng;通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明,仅TSWV呈现阳性反应,说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV,可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。     

利用降落PCR扩增KS基因

通过优化SDS法提取链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)和2株由生物技术与资源利用国家民委——教育部重点实验室分离获得的放线菌D8和D18基因组DNA,同时应用降落PCR和普通PCR扩增酮基合酶基因(ketosynthase,KS)。结果表明,扩增出的特异性条带与目的基因片段长度一致,降落PCR法较普通PCR法扩增KS基因特异性更高。使用普通Taq酶,降落PCR程序能明显提高PCR的特异性,它可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

骆驼刺ISSR-PCR反应体系的建立

用CTAB法提取叶片DNA,然后通过单因素实验,研究了Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素对ISSR-PCR扩增的影响,建立了适合于骆驼刺的ISSR-PCR反应体系,其为25μL总体积中含1×PCR反应缓冲液(无Mg2+)、1.5U Taq DNA聚合酶、0.6 mmol/L dNTPs、0.6μmol/L引物、1.5 mmol/L MgCl2。     

产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法

[目的]介绍一种PCR产物直接进行"TA"克隆的高保真PCR法,减少高保真PCR产物"TA"克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA,并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行"TA"克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变,但不能直接进行"TA"克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行"TA"克隆,但其内部存在多个突变位点,保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶(双酶联用)扩增的PCR产物可直接进行"TA"克隆,且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物,并直接进行"TA"克隆。     

Taq DNA聚合酶的热纯化制备（摘要）

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21（DE3）宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。     

Taq DNA聚合酶的热纯化制备

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用TaqDNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21（DE3）宿主茵中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的珊DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。     

土壤微生物总DNA的V_3可变区PCR反应体系优化

为了优化以土壤微生物DNA为模板的PCR反应条件,采用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取土壤微生物总DNA,对16SrDNA V3可变区的PCR反应体系和反应条件进行优化。主要从DNA模板用量、引物浓度、退火温度、热启动方式4个方面进行筛选试验,最后得出最适宜的土壤DNA扩增体系为:10.5ng模板DNA、5μL 10×buffer、4μL 2.5mmol/L dNTP、10μmol/L引物各1.5μL,2.5UTaq酶,加无菌ddH2O补足至50μL;PCR循环程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸70s,29个循环;72℃延伸5min。试验结果表明:选择热启动方式和合适的退火温度是获得高质量PCR产物的关键。     

重组Taq DNA聚合酶的表达和纯化鉴定

【目的】表达、纯化Taq DNA聚合酶,并检测其扩增性能。【方法】活化含Taq DNA聚合酶基因的菌株JM109,IPTG诱导表达。目的蛋白利用AKTA蛋白纯化系统,依次过Affi-Gel Blue Sepharose,Heparin Sepharose Fast Flow,Q-Sepha-rose Fast Flow,经SDS-PAGE分析,以国外进口Taq酶为标准,采用对比法初略测定酶活性,验证产品质量。【结果】制备的Taq DNA聚合酶具有扩增效率高、纯度高、特异性强、无核酸酶污染、活性稳定等优点。【结论】成功表达纯化Taq DNA聚合酶,其扩增性能达到甚至超过国外同类产品。     

黑麦特异性PCR反应体系的建立（摘要）

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTABDNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40ng引物,40～60ng模板DNA,1UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,可为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定基础。     

SELEX技术中ssDNA文库PCR扩增条件的优化(英文)

[目的]对SELEX技术中ssDNA文库的PCR扩增条件进行优化。[方法]采用L16(45)正交试验设计在4个水平上对影响单链随机DNA文库PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度和随机单链DNA文库量5个重要因素进行了优化,同时对PCR反应的退火温度和循环次数进行了优化,确立最优反应体系和扩增程序。[结果]20μlPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer2.0μl,随机ssDNA文库0.5ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.25mmol/L,上下游引物各0.6μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U;退火温度为68℃,最佳循环数为12。此反应系统下,随机ssDNA文库PCR扩增谱带清晰、稳定、特异性高。[结论]为SELEX技术中筛选到特异性更强的适配子奠定了基础。     

松阿扁叶蜂SSR-PCR反应体系的优化

以SDS-蛋白酶K法提取的松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)基因组DNA为模板,利用L16(45)正交设计对影响松阿扁叶蜂SSR-PCR反应的主要参数DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物和dNTPs进行优化.结果表明,松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00U Taq DNA 聚合酶、3.00 mmol/L Mg2+、3.75 mmol/L dNTPs、25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物.     

SELEX技术中ssDNA文库PCR扩增条件的优化

[目的]对SELEX技术中ssDNA文库的PCR扩增条件进行优化。[方法]采用L16(45)正交试验设计在4个水平上对影响单链随机DNA文库PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度和随机单链DNA文库量5个重要因素进行了优化,同时对PCR反应的退火温度和循环次数进行了优化,确立最优反应体系和扩增程序。[结果]20μlPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer2.0μl,随机ssDNA文库0.5ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.25mmol/L,上下游引物各0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5U;退火温度为68℃,最佳循环数为12。此反应系统下,随机ssDNA文库PCR扩增谱带清晰、稳定、特异性高。[结论]为SELEX技术中筛选到特异性更强的适配子奠定了基础。     

大叶栎ISSR扩增体系的优化

[目的]探讨影响大叶栎ISSR扩增效果的因素,建立大叶栎ISSR扩增的优化体系。[方法]以新嫩的大叶栎叶片为试材,采用改良CTAB法提取大叶栎叶片基因组DNA,并将DNA浓度稀释到30ng／μl,采用单因素试验设计测试DNA模板、PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶的用量以及底物dNTP终浓度和引物终浓度对ISSR扩增的影响。[结果]大叶栎的ISSR扩增的最优反应体系为：总体积20μl中含有DNA模板60ng、PCR缓冲液10×buffer为2．0μl,底物dNTP终浓度为0．25mmol／L,引物终浓度为0．3μmol／L,TaqDNA聚合酶为1U。在该体系下,能够扩增出清晰、多态性高的条带,能够满足大叶栎种群ISSR多样性分析的要求。[结论]建立了大叶栎ISSR扩增的优化体系,为研究广西的大叶栎种群遗传多样性提供了技术基础。