猪圆环病毒3型7个ORFs不能诱导PK-15细胞凋亡

【目的】为了探明猪圆环病毒3型的致病机制。【方法】用PCR技术扩增PCV3的ORF1-ORF7基因片段并克隆到pEGFP-C1载体,构建7个真核表达质粒后分别转染PK-15细胞,在转染后不同时间观察细胞中荧光表达情况,并检测Caspase-3活性变化。【结果】7个真核表达质粒转染PK-15细胞后均可观察到荧光,表明PCV3的ORF1-ORF7基因均可在PK-15细胞中获得表达,但在表达丰度方面存在差异。与单独的PK-15细胞和pEGFP-C1载体转染的PK-15细胞相比,7个真核表达质粒转染PK-15细胞后都未出现Caspase-3活性的显著(P0.05)变化,表明均未引起PK-15细胞发生凋亡。【结论】PCV3的ORF1-ORF7基因均无诱导PK-15细胞发生凋亡的作用。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒构建及其免疫原性的研究

 【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量（CD4+和CD8+）以及淋巴细胞增殖反应（MTT法）水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的克隆及原核表达

以细胞总基因组提取试剂盒抽提PCV2细胞毒株总DNA为模板,用特异性引物扩增PCV2 ORF3基因。将ORF3和表达载体pGEX-6p-1用BamH I和Sal I双酶切回收后连接,将测序验证为阳性的重组质粒命名为pGEX-6p-1-ORF3。重组质粒pGEX-6p-1-ORF3转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达并纯化,对获得的表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测。结果表明:PCV2 ORF3在pGEX-6p-1中获得了高效表达,其表达蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约为37 kD,且能够和PCV2阳性血清发生特异性相互作用,具有免疫学活性。     

猪圆环病毒2型ORF5编码非结构蛋白的表达

【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)中ORF5所编码非结构蛋白(NS)的功能。【方法】根据Gen-Bank已发表PCV-2基因组序列设计特异引物,分别以HZ0201株(AY188355)、美国98-15237株病毒DNA为模板,采用PCR法扩增PCV-2ORF5基因,并构建了pGEX-4T-1-ORF5原核表达载体和pEGFP-C2-ORF5真核表达载体,对ORF5重组蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析,用真核表达载体pEGFP-C2-ORF5转染PCV-2易感细胞PK-15。【结果】PCV-2ORF5基因长162bp,编码54个氨基酸;其所编码蛋白在E.coli中以包涵体形式存在,分子质量大小约为32ku。【结论】PCV-2ORF5编码重组蛋白在真核PK-15细胞中成功表达。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果

【目的】构建含PCV2ORF1和ORF2基因的串联重组腺病毒,并对其免疫效果进行评价。【方法】扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行检测。【结果】得到了PCV2的ORF1和ORF2基因,pMD18-ORF1-ORF2和pAdCMV-ORF1-ORF2载体构建成功,获得了含有PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒。该重组腺病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中可检测到PCV2的特异性抗体。【结论】成功构建了含PCV2ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,此腺病毒可诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体。     

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。     

类猪圆环病毒P1-ORF1真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-ORF1的构建

为研究类猪圆环病毒P1-ORF1能否在真核细胞中表达,本文通过PCR技术扩增P1-ORF1基因,利用pc DNA3.1(+)载体构建重组质粒pc DNA3.1(+)-ORF1,通过lipofectamine 2000脂质体介导转染PK-15细胞以表达P1-ORF1基因,再通过RT-PCR及免疫组织化学技术从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达。结果显示:从转染的细胞中提取总RNA,经Recombinant DNase I处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出359 bp的目的片段;免疫组化分析显示:pc DNA3.1(+)-ORF1重组质粒样品能够与抗P1-ORF1多克隆抗体发生特异性反应。研究结果表明类猪圆环病毒P1-ORF1真核表达质粒pc DNA3.1(+)-ORF1构建成功,为进一步研究P1-ORF1蛋白的免疫学特性奠定基础。     

斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/6/7基因真核载体的构建

针对PRRSV ORF5～ORF7设计3对特异性引物,以PRRSV GD-XH株和GD08-1株为模板进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7),然后将重组表达质粒转染Marc-145细胞.通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N1-(ORF5～ORF7)和载体pEGFP-N1均有绿色荧光出现.结果表明:成功构建了表达PRRSV GD-XH株和PRRSV GD08-1株的GP5、M、N蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1-GD-XH-GP、pEGFP-N1-GD-XH-M、pEGFP-N1-GD-XH-N、pEGFP-N1-GD08-1-GP5、pEGFP-N1-GD08-1-M、pEGFP-N1-GD08-1-N.     

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) ORF25蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)ORF25基因的部分基因序列,并将扩增产物连接到原核表达载体pGEX-KG,成功构建了CyHV-2-ORF25-KG重组质粒。IPTG将其诱导后,SDS-PAGE分析表明:目的蛋白得到表达,分子质量大小为42ku,且主要以包涵体形式存在;用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,多次免疫后通过细胞融合,筛选出1株单抗5C6;经间接免疫荧光试验和Western blot试验验证,这株单抗可以识别CyHV-2ORF25蛋白。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

参照Genbank上公开发表的PCV1全基因序列设计引物,以质粒pSK-PCV为模板扩增出PCV1-ORF2基因,插入pMD18-T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1基因序列相比较,同源性达97％,再与Genbank上发表的PCV2的ORF2基因序列相比较发现PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1-ORF2的氨基酸序列同PCV2-ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

猪戊型肝炎结构基因ORF2的克隆及其植物表达载体的构建

通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆了戊型肝炎病毒主要结构基因ORF2部分片段,大小为681 bp,将其克隆于pMD18-T载体。序列分析表明,与GenBank公布的序列一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体p35S-2300-two-T-DNA-4×Ta1上,并将载体p2300上的CaMV35S启动子替换为E12启动子,构建成植物表达载体p2300-ORF2-E12。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得了携带ORF2基因的根癌农杆菌菌株,为转基因植物工作奠定了基础。     

鳗鲡疱疹病毒ORF87基因克隆及其多克隆抗体的制备

【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus,AngHV） ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株（NC_013668）的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至pET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21 （DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源（相似性为99.72%）,仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点（pI）为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族（PKC-like Superfamily）的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1:16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】 AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

试验以猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）的ORF5和猪圆环病毒2（PCV-2）的ORF2为目的基因,以pIRES-neo为表达载体,构建了PRRSV—PCV-2二联核酸疫苗,并对其免疫原性进行了初步的研究,为研制安全有效的疫苗防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供基础。     

猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的构建及其免疫效力

[目的]构建猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病的二联核酸疫苗并研究其免疫效果。[方法]将辽宁某猪场发病猪病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES-neo的CMV启动子下游,然后用猪2型圆环病毒（PCV-2）的内蒙古分离株的ORF2基因替换pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过W estern blot和IFA方法检测构建的重组质粒在BHK细胞中的表达情况。将重组质粒免疫Balb/c小鼠,检测免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群的数量。[结果]成功构建了重组表达质粒pIRES-ORF2-ORF5,W estern blot和IFA试验证实该重组质粒在BHK细胞内成功表达了目的蛋白。与灭活苗相比,pIRES-ORF2-ORF5核酸疫苗免疫小鼠ELISA抗体水平差异不显著;其脾T淋巴细胞亚群数量显著高于灭活疫苗免疫组。[结论]构建的二联核酸疫苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,为更好地防制猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病提供了条件。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。