结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子的克隆和测序

根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)热休克蛋白70启动子的基因序列设计1对引物,PCR扩增出150 bp的片段后连接到pMD18-T载体上,用重组质粒载体转化大肠杆菌DH5α,PCR鉴定转化菌后进行序列测定。结果表明,该序列与已报道的3株结核分枝杆菌和1株牛型分枝杆菌的相应序列完全同源。该序列可用于构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒载体,启动外源基因在卡介苗菌中的表达。该基因的克隆可为下一步研究开发人和动物以卡介苗为载体的多价活疫苗打下基础。     

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析

以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体.经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65.序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K～10株的同源性为99.2%.     

牛分枝杆菌广西分离株ESAT-6基因鉴定及遗传进化分析

根据GenBank中牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）的ESAT-6基因序列（No：BX248347）设计1对引物,PCR扩增获得2株牛分枝杆菌广西分离株（mt359、mt370）,纯化产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,对经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序及同源性比较分析。结果表明,牛分枝杆菌广西分离株mt359、mt370与GenBank中已发表的6株毒株（5株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌）的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为100.0%,与牛分枝杆菌标准株C680001的核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为96.6%。说明致病性牛分枝杆菌的ESAT-6基因十分保守,不存在种间差异。     

鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建

根据发表的鹅细小病毒GPV B株全基因组设计一对引物,采用PCR方法扩增出鹅细小病毒扬州株(GPV YZ)非结构蛋白基因NS1,克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109。经菌液PCR、双酶切及质粒PCR鉴定后,将阳性重组质粒转化感受态农杆菌LBA4404。经菌液PCR及质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-NS1,该载体的构建为进一步研究鹅细小病毒NS1基因的分子生物学特性打下良好基础。     

单核细胞增生性李斯特菌iap基因的原核表达

该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌 Listeria monocytogenes C5305 株的iap基因,在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定后获得重组质粒 pET-28a-iap,将该重组质粒转化人大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS,经1 mmol/LIPTG诱导4～6 h后,通过SDS-PAGE及Western-blotting鉴定,证明该基因得到表达,表达产物相对分子质量约为60 000,以可溶形式存在.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

气肿疽延边株FliA基因真核表达载体的构建

为构建气肿疽延边株FliA基因的真核表达载体PVAX1-FliA,根据Genbank气肿疽鞭毛基因(登录号:AB058932)的参考序列,利用Primer 5.0设计1对引物,通过PCR扩增出完整的气肿疽延边株FliA基因。将目的基因与pMD-19T载体连接转化到大肠杆菌DH5α,进行测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆质粒。用回收后的基因与真核表达载体PVAX-1连接,并经双酶切、测序鉴定。本试验成功构建了鞭毛基因的重组真核表达载体PVAX1-FliA,为探讨气肿疽延边株FliA基因的分子生物学特性和功能及免疫新途径提供依据。     

顺反子序列bioI-orf2-orf3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioI-orf2-orf3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747。从5μg/m l的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上。     

芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

应用基因工程技术将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段（Stilbene synthase，STS）进行PCR扩增；把回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-TEasy中进行测序与序列分析；采用定向克隆的方法将芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型酿酒酵母表达载体pYES6／CT上，转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVScl，酵母菌落PCR电泳结果显示，在约1200bp处有一条亮带，证明芪合酶基因酵母表达载体构建成功，为后期工作的开展奠定了基础，并为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的实验素材。     

顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747.从5μg/ml的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上.     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白（GZFP）的融合蛋白．以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b（＋）中,转化宿主菌BL21（DE3）,成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET—GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达．     

细菌表面表达载体的构建与鉴定

用聚合酶链式反应(PCR)技术，从金黄色葡萄球菌中扩增出769bp的编码SPA细胞壁跨膜区的编码序列。将扩增的片断克隆进pEZZ-18载体BamHI和sall位点之间。重组质粒转化大肠杆菌HB101后，根据酶切分析筛选到含有目的基因的重组质粒pZSPAX。序列测定结果表明，该重组质粒中的插入序列与已发表的SPA-X是一致的。通过水肿病毒素B亚单位(SLT-IIeB)基因(slt-IIeB)证实质粒pZSPAX能作为在细菌表面表达目的基因的载体。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

禽呼肠孤病毒分离株σ2蛋白基因克隆及序列分析

为了解禽呼肠孤病毒（ARV）广西分离株与常用疫苗株在基因水平上的差异,将从广西某鸡场分离获得的2株ARV（R1、R2）分离株的σ2蛋白基因经RT-PCR扩增后,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α,重组质粒经PCR、双酶切鉴定及序列分析。结果表明,2株ARV分离株的σ2蛋白基因已成功克隆到质粒载体上;经序列分析发现,2株ARV分离株与ARV标准株S1133的核苷酸同源性分别高达99.2%和99.3%,其推导的氨基酸同源性分别高达98.1%和98.4%;两分离株间的核苷酸同源性为99.7%,其推导的氨基酸同源性为98.5%,具有很高的同源性。     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

分枝杆菌中表达重组蛋白的新载体pMSL的构建

为了能够利用耻垢分枝杆菌表达和纯化结核分枝杆菌蛋白,构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pMSL。该质粒包括来源于牛型分枝杆菌hsp60基因启动子序列,目的蛋白插入的克隆位点和用于目的蛋白表达和定位进行跟踪的绿色荧光蛋白质（EGFP）基因,在目的蛋白插入位点和EGFP基因之间整合了凝血酶识别位点,便于融合蛋白纯化后目的蛋白与EGFP分离,在EGFP基因后面融合有6个组氨酸的密码子。结果表明,pMSL质粒能够在耻垢分枝杆菌中有效地表达绿色荧光蛋白,通过6个组氨酸尾,利用Ni—NTA亲和层析柱很好地被纯化。     

福氏志贺菌主动外排基因acrB的克隆与序列分析

以福氏志贺菌2a型菌株基因组为模板,经PCR扩增得acrB基因,将该基因克隆到pMD18-T Vector载体,将重组质粒进行PCR和酶切鉴定及序列测定.结果表明:测定序列与Genbank收录的福氏志贺菌参考序列同源性为99.7%,与大肠杆菌的acrB基因序列比较分析,序列同源性在98%~99%之间,说明志贺菌主动外排基因acrB在碱基序列和编码的氨基酸序列上均与大肠杆菌有很高的同源性,它可能是志贺菌引起多重耐药的主要原因.     

诺丽ACO基因超量表达及干涉表达载体的构建及鉴定

为构建诺丽ACO基因的超量表达及干涉表达载体,为后期对诺丽进行转基因操作,探究诺丽ACO基因的功能奠定基础。试验前期克隆了诺丽ACO基因的基础上,设计合成了ACO基因的超量表达及干涉表达的引物,采用PCR技术扩增出了目的基因,将扩增出的目的基因分别插入质粒Hellsgate 8、Hellsgate 2,转化大肠杆菌。结果表明:转化大肠杆菌并进行菌落PCR检测,筛选出结果较好的阳性克隆进行测序,测序后与诺丽ACO序列相比较,序列只有几个碱基的差别。取结果较好的超量表达及干涉表达载体质粒电转农杆菌,均能得到清晰而明亮的条带。本课题组利用前期克隆出的ACO基因,试验得到了诺丽ACO基因的超量表达及干涉表达载体质粒。     

大肠杆菌F18菌毛FedE蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18菌毛E亚单位的基因序列(fedE)设计1对引物,利用PCR技术从重组质粒TFl07E中扩增到一段序列,并按预定的阅读框架插入到表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedE,并转化大肠杆菌BL21获得重组菌PPFedE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明：该序列大小为459bp,与GENEBANK中的FedE结构编码序列(Z26520)完全一致。通过对菌体裂解物的SDS—PAGE电泳分析以及Western blotting鉴定,证明重组大肠杆菌PPFedE的可以表达融合蛋白形式的FedE(命名为GST-FedE),即FedE蛋白(16．297ku)与谷胱苷肽转移酶(27．335ku)相连组成分子量为43．632ku的融合蛋白。     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。