猪伪狂犬病病毒检测方法研究进展

伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)、a-疱疹病毒亚科(Alpherpesvirinae)，可引起多种动物的临床或亚临床感染。猪是该病毒最主要的贮存宿主和传染源。本病毒可引起怀孕母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎；新生仔猪发热、神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率可达100％；成年猪多耐过而呈隐性感染，成为该病的主要传染源。有资料     

猪伪狂犬病病毒LAMP可视化检测方法的建立

根据Gen Bank中猪伪狂犬病病毒(PRV)g B基因的保守序列,设计一套特异性引物,在对反应条件进行优化后,建立了PRV环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法。结果显示:该方法能在常规65℃水浴锅中30 min内实现对目的片段的特异性扩增,并且可通过肉眼观察颜色直接判定检测结果 ;该方法具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;该方法的敏感性可达1 fg;将该方法应用于临床样品检测,结果与普通PCR方法一致。研究表明,本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合基层PRV感染的快速检测。     

猪伪狂犬病诊断方法研究进展

伪狂犬病是由猪疱疹病毒1型引起的除人和猿以外的所有哺乳动物共患的一种传染病.感染仔猪表现发热、腹泻、呼吸困难、肌肉震颤并继发麻痹、共济失调,母猪表现繁殖障碍,对养猪业造成了巨大的损失.为此,国内外广大兽医科技工作者对伪狂犬病诊断与检测方法进行了大量的研究,建立了病毒分离、动物接种等传统诊断方法,以及大量的血清学、分子生物学诊断与鉴别诊断方法.其中使用分子生物学手段建立的gE鉴别ELISA方法在美国等国家用于伪狂犬病的根除计划并取得了良好效果.研究伪狂犬病的诊断与检测方法对防控伪狂犬病的暴发和传播有重要意义.     

猪伪狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因的序列（EF552427）,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9999,最低检测的拷贝数为35.4拷贝/25μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点。本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),设计并合成1对引物.通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.999 9,最低检测的拷贝教为35.4拷贝/25 μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点.本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.     

猪伪狂犬病研究进展

伪狂犬病又称奥叶基氏病,是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是该病的主要宿主和传染源,感染仔猪出现发热、腹泻、呼吸困难、肌肉震颤、麻痹、共济失调;母猪出现繁殖障碍,给世界养猪业造成了巨大的损失。猪伪狂犬病是严重危害养猪业的重要疫病之一,国内外众多学者对其进行了大量研究,建立了多种诊断与鉴别诊断方法,研制了不同类型的疫苗。文章对该病的病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断和防控方面的研究进展做一综述,重点介绍猪伪狂犬病的诊断与抗原、抗体检测方法。     

猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

当前猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒（并作为阳性质粒）,针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR检测下限为4.545×102拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2（圆环病毒2型）、PPV（细小病毒）、PRRSV（蓝耳病病毒）、PEDV（流行性腹泻病毒）和TGEV（传染性胃肠炎病毒）等不产生交叉反应。此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率（13.33%,2/15）。因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。     

猪伪狂犬病PCR与ELISA检测方法研究进展

猪伪狂犬病(PR)在全球广泛流行,给猪养殖业造成了严重的损失。如何实现对该病快速、准确、方便、价廉地的诊断具有重要意义。PCR和ELISA具有操作简便、灵敏度高、结果判定简单、成本低等优点,可广泛应用于一线兽医队伍快速检测PR。本文就PCR和ELISA技术在猪伪狂犬病诊断方面的最新研究情况进行了综述,以期为PR的快检快筛检测提供参考。     

猪伪狂犬病诊断方法研究进展

猪伪狂犬病是由猪疱疹病毒I型引起的一种高度传染性、致死性的传染病。其疾病的传播是由易感母猪传染给新生仔猪,导致仔猪呼吸困难、发热、精神沉郁、呕吐、下痢、震颤而大批死亡,给养猪业造成巨大的经济损失。为了减少该病的发生,广大兽医工作者建立了许多检测和诊断的方法,为有效的控制伪狂犬病的暴发提供了有力的保证。     

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法.实验结果表明,当50 pmol/L的引物O.3μL和5 pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍.该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.     

流感病毒核酸检测方法研究进展

流感病毒可以引起人和动物高度接触性传染性疾病,对公共卫生和畜禽养殖业均造成极大的威胁.因此,准确而又快速的诊断方法对流感的防控起着非常重要的作用.近年来,流感病毒的核酸诊断技术发展较快,主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等.论文对这些诊断技术的基本原理和应用现...     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆

参照伪狂犬病病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）ＮＩＡ－３株ｔｋ基因序列,设计并合成１对长２２ｍｅｒ的引物,引物间距１．５ｋｂ,其内包含完整的ＰＲＶｔｋ基因。以ＢＨＫ２１细胞繁殖的ＰＲＶ湖北地方强毒株（ＨＳ－９３０４）基因组为模板进行ＰＣＲ扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示扩增主带清晰,长约１．５ｋｂ,符合设计要求。扩增片段克隆至由ｐＵＣ１８质粒改制而成的Ｔ载体中,限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切分析证实,扩增片段的酶切位点与ｔｋ基因一致,说明扩增和克隆片段包含ＰＲＶｔｋ基因。     

牛病毒性腹泻病毒LAMP检测方法的建立与应用

针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5'UTR基因(GenBank登录号:AY278459.1)序列设计4条特异性环介导等温扩增 (LAMP) 引物,特异性识别靶基因序列上4个独立区域,采用LAMP技术,利用实时浊度仪实时检测LAMP 反应过程中所产生的焦磷酸镁白色沉淀,实时监测反应液浊度来判断反应结果,实现对扩增反应全过程的监控,建立BVDV的LAMP快速检测方法。通过实时浊度仪在恒温63 ℃下50 min完成检测,对方法的特异性、灵敏度、重复性进行了评价。结果显示,经优化该方法只检测BVDV阳性,特异性强;病毒10^-6倍稀释时仍能被检测到,比PCR方法灵敏度至少高100倍;重复性良好。LAMP实时浊度法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优势,为BVDV的临床检测提供了一种简单快速的试验手段。     

Establishment and Application of LAMP Detection Method of Bovine Viral Diarrhea Virus

Since the 5'UTR gene (GenBank No.:AY278459.1) had 4 isolated regions,we designed a set of 4 LAMP primers to specifically recognize target gene sequences.This study developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detecting BVDV,using the pyrophosphate magnesium white precipitate for Real-time detection in LAMP reaction process of turbidity instrument,Real-time monitor liquid turbidity to determine result.The whole reaction lasted only 50 minutes at a constructed temperature of 63 ℃ to evaluate specificity,sensibility and repeatability of the method.The result demonstrated that the LAMP assay could only react with BVDV,its specificity was high;It could detect at least 10^-6-fold diluted samples,which was 100 more sensitive than PCR assay;And repeatability was good.The simple,rapid,high siensitivity and specificity LAMP assay was a potential tool for the detection of BVDV in field conditions.     

猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法.结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43％～0.64...     

3种新城疫病毒核酸扩增检测方法的比较研究

本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg^2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。     

脑心肌炎病毒检测方法研究进展

脑心肌炎由脑心肌炎病毒(EMCV)引起,主要导致猪脑炎、心肌炎及母猪的繁殖障碍,该病的发生与流行严重影响我国养猪业的发展。论文综述了各种EMCV检测方法及其优缺点,为更有效的EMCV检测方法的建立提供参考。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的克隆与序列测定

用PCR方法以伪狂犬病病毒闽A株的基因组DNA为模板扩增到了gE基因表位抗原决定域的编码区段。PCR产物连接到pMD18-T载体后，转化大肠杆菌XL1－blue菌株，重组质粒经测序并与GenBank中已登录的gE基因序列比较，确证含有PRV闽A株gE基因的表位抗原编码区，此区段与PRV Rice株相应区段的DNA序列同源性为97．3％，氨基酸序列同源性为94．7％。