筏式养殖虾夷扇贝“褐色沉积症”形成原因初步研究

为分析筏式养殖虾夷扇贝贝壳内侧褐色沉积症状形成机制,讨论虾夷扇贝夏季大规模死亡和褐色沉积症状相关性。2017—2019年的3—10月开展流行病学调查,调查虾夷扇贝褐色沉积症症状发生过程和出现比例,统计虾夷扇贝累积死亡率。设计防咬合扇贝养殖笼,统计褐色沉积症扇贝出现比例。利用傅里叶红外光谱分析法分析褐色沉积物质成分,讨论内在形成原因。结果显示,防咬合扇贝养殖笼内养殖扇贝累积死亡率为87.6%,褐色沉积症状出现比例为74.5%,扇贝间咬合导致的损伤不是褐色沉积症出现的原因。褐色沉积物质红外光谱谱型与牛血清白蛋白粉末谱型一致,且具备蛋白质特征峰酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带,揭示贝壳内侧褐色沉积物质主要成分为蛋白质。虾夷扇贝褐色沉积症出现时间具有规律性,6月中下旬出现症状后持续至8月,与扇贝开始死亡时间吻合。2017—2019年褐色沉积症状比例为85.7%、1.54%和10.9%,扇贝累积死亡率分别为90.4%、49.2%和48.16%,揭示褐色沉积症状与筏式养殖虾夷扇贝夏季死亡具有相关性(r=0.992),其形成原因可能与病原感染相关。     

虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cDNA文库构建以及EST的初步分析

利用SMARTcDNA文库构建试剂盒首次构建了健康虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)外套膜和肾脏2种组织的cDNA文库。2个文库容量分别为2.30×106CFU/mL和1.20×106CFU/mL,重组率均超过98%,平均插入片段长度均大于1kb,文库质量符合标准要求。将随机选取的4009个克隆进行5′端测序,得到3884个有效序列(外套膜923个,肾脏2961个),测序成功率96.9%。经过质量控制和拼接,共得到2007条单基因簇(Unigenes),包含363个序列重叠群(Contigs)和1644条单一序列(Singletons)。通过BLASTx和BLASTn搜索比对,共有659个Unigenes(外套膜157个;肾脏502个)获得了基因注释(Ee-5),占Unigene总数的32.84%。对Unigene的功能和分类进行了初步分析,发现多种与免疫相关的基因,如凝集素、超氧化物歧化酶、溶菌酶、大防卫素等。利用SSRIT在线工具对2007条Unigene查找微卫星,发现有69个EST中含有微卫星序列,其中40个可以用于引物设计。虾夷扇贝cDNA文库的成功构建,为进一步的EST分析、功能基因的表达和克隆、多态性EST-SSR的筛选以及虾夷扇贝分子遗传学研究、种质资源评价和分子选育等奠定了基础。     

虾夷扇贝肌动蛋白基因cDNA序列克隆与分析

采用RT-PCR和RACE法从虾夷扇贝闭壳肌中分离和克隆了肌动蛋白基因cDNA全长序列.肌动蛋白基因cDNA全长1775 bp(不包括poly A),5′端非编码区94 bp,3′端非翻译区551 bp,阅读框1131 bp,编码376个氨基酸.在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第42和第43个氨基酸之间,长度为2041 bp.系统发育分析显示该肌动蛋白属于α类型.     

基于高通量测序的虾夷扇贝基因组微卫星特征分析

为全面了解虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)微卫星分布频率和数量,深化对虾夷扇贝基因组的认识,本研究运用第二代高通量测序技术,进行虾夷扇贝简化基因组测序(RAD-seq),从基因组水平阐明虾夷扇贝基因组微卫星特征。结果显示,简化基因组测序共获得序列总长为92,551,435 bp,经过滤筛选,获得259,535个contig,其中,包含微卫星序列3618条,经引物设计共获得3460对微卫星引物。统计微卫星序列的重复类型,其中,三核苷酸重复单元数量最多(1587个,45.87%),其次是二核苷酸重复(1282个,37.05%),六核苷酸重复单元数量最少(20个,0.58%)。在三核苷酸重复中,以ATA重复类型所占比例最高(11.41%),共计181个。此外,虾夷扇贝同一重复类型的微卫星随着重复数增加其数量相对减少,而相同重复数的微卫星随着重复单元长度的增加其数量也呈下降趋势,可见微卫星长度与其数量呈负相关,表明长度较短的微卫星变异速率较快。本研究结果为认识虾夷扇贝基因组特征和在基因组水平开展种群遗传学研究提供了基础数据。     

内参基因在虾夷扇贝定量PCR中表达稳定性的比较

应用实时荧光定量技术,检测虾夷扇贝的β-actin、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogen-ase、α-tubulin、Cytochrome b5、TATA box binding protein-associated factor、Elongation factor 1α共6个内参基因在饥饿胁迫下各组织、致病菌感染前后和水环境升温前后不同时间段血样中的mRNA表达情况。经geNorm程序统计分析,6个内参基因在上述处理中的表达稳定性存在差异,导致不同处理中适用的内参基因有所不同。为进一步开展虾夷扇贝基因表达的定量研究奠定了基础。     

虾夷扇贝Dmrt1基因的分子鉴定及表达模式分析

Dmrt1是Dmrt双性和mab-3相关转录因子基因家族的重要成员之一,在生殖细胞分化和性别调控中发挥着重要作用.为探究其在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性别分化中的表达调控模式,本研究利用生物信息学的方法分析了虾夷扇贝Dmrt1的序列特征;采用半定量PCR (RT-PCR)检测了Dmrt1...     

不同海区虾夷扇贝采苗效果及分析

2012年在老铁山黄渤海分界线附近海区和位于旅顺渤海沿岸的董坨子海区进行了不同海区虾夷扇贝海区采苗试验,比较分析了不同海区的采苗效果。结果表明,位于黄海海域的铁山东采苗水平为3 600枚/袋,平均壳高2.1mm;位于渤海海域的铁山西采苗水平为528枚/袋,平均壳高2.0mm;位于旅顺渤海沿岸的董坨子海区采苗水平为216枚/袋,平均壳高为1.9mm。虾夷扇贝海区采苗效果,主要取决于采苗海区的浮游幼虫数量,尤其是即将附着的成熟幼虫数量和持续时间。即成熟幼虫数量多、持续时间长,采苗效果好,反之采苗效果差。     

虾夷扇贝肌原纤维蛋白热稳定性的季节性差异

为探究虾夷扇贝原料特性的季节性差异,分别对春(4月)、夏(7月)、秋(10月)和冬(1月)产鲜活虾夷扇贝的商品属性及闭壳肌ATP和ATPase分布进行了分析比较;以肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,Mf)Ca²⁺ATPase活性为检测指标,重点探索闭壳肌蛋白热稳定性的季节性差异,并对闭壳肌2种肌肉即横纹肌和平滑肌的蛋白热稳定性做了对比分析。结果显示,春季虾夷扇贝最肥满,生殖腺占总重的比率高达6.96%,其他3个季节仅为1.79%～2.95%。主要可食部位闭壳肌的蛋白质、脂肪和ATP的含量季节性差异不明显,闭壳肌富含蛋白质,含量占干基的75%～80%,脂肪含量很低,仅为0.63%～1.00%;值得关注的是,在春、夏2个季节闭壳肌总糖含量分别为11.14%和13.84%,显著高于秋、冬2季,而冬季含量最低,仅为2.67%。横纹肌ATP含量在各个季节都高于平滑肌,二者分别为4.3～5.0μmol/g和1.2～1.6μmol/g。横纹肌与平滑肌的ATP及其关联物含量的季节性差异均不明显。此外,横纹肌与平滑肌具有相似的热稳定性,在30和35℃下加热30...     

低氧胁迫下虾夷扇贝的行为特征及生理生化响应

为研究低氧胁迫对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)行为、生理生化(免疫防疫功能及关键呼吸酶)的影响, 设置了 1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、7 mg/L (对照组) 4 个溶解氧梯度, 测定分析了虾夷扇贝行为特征(外壳的开闭合程度大小)、耗氧率、排氨率、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD), 过氧化氢酶(CAT)]和呼吸相关酶[乳酸脱氢酶(LDH) 和丙酮酸激酶(PK)]活性的响应情况。结果发现: (1)虾夷扇贝的存活率随着 DO 浓度的降低而降低, DO=1 mg/L 时的存活率仅为 55%; 在 DO=1 mg/L, 2 mg/L 和 4 mg/L 时, 虾夷扇贝的半致死时间分别为 95.97 h、147.37 h 和 209.58 h。 (2)将扇贝行为特征划分为 5 个等级, 按照 0~4 赋分, 评分越高, 代表扇贝状态越好。从扇贝行为特性的量化指标来看, DO 浓度越低, 评分分数越低, 虾夷扇贝状态越差。(3)低氧胁迫对虾夷扇贝耗氧率、排氨率有显著影响(P＜0.05), 在 DO≤2 mg/L 下, 氧氮摩尔比＜7, 虾夷扇贝主要由蛋白质供能; DO≥4 mg/L, 虾夷扇贝由蛋白质和脂肪氧化供能为主。(4)低氧胁迫对虾夷扇贝 SOD、CAT 和呼吸酶有显著性影响(P＜0.05)。24 h 的低氧胁迫使得肝胰腺及闭壳肌的自由基 ROS浓度升高; 48~96 h的低氧胁迫下, SOD、CAT酶活开始降低。不同的溶解氧浓度下代谢途径不同, DO= 2 mg/L 时, 有氧呼吸代谢转变为葡萄糖-丙酮酸-乳酸的呼吸途径; DO=1 mg/L 时, 呼吸代谢途径可能优先选择葡萄糖-琥珀酸途径。从生理生化层次上来看, 免疫功能下降和呼吸代谢途径改变可能会引起虾夷扇贝行为特征改变。     

转录组测序研究三角帆蚌珍珠颜色相关基因

为筛选影响三角帆蚌珍珠颜色的候选基因,采用转录组测序平台Illumina Hi Seq TM2500对蚌壳珍珠层颜色为紫色和白色的三角帆蚌中央膜组织进行高通量测序。所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。结果显示,获得干净数据共72 800 581 bp,拼接获得了89 529个Unigene,差异表达基因2644个,其中上调表达基因1323个,下调表达基因1321个。根据GO功能分类可分为分子功能、细胞组分、生物过程等3大类50分支;根据KEGG代谢通路分析可以分为187类。对差异表达基因分析发现,部分基因与色素合成(眼黄素、黑色素、喋啶色素)及金属离子转运相关,还有6个细胞色素P450,3个细胞色素b561和1个细胞色素b560。研究表明,这些基因可能在珍珠颜色形成中发挥作用。     

Discovery of host defence genes in the Japanese scallop Mizuhopecten yessoensis Jay by expressed sequence tag analysis of kidney tissue

The Japanese scallop Mizuhopecten yessoensis is one of the most important aquaculture mollusca in Japan and China. In the present study, a high‐quality cDNA library of the Japanese scallop was constructed from the kidney tissue. A total of 2919 expressed sequence tags longer than 100 bp were generated from this library. A cluster of 1440 unique sequences, which consisted of 258 contigs and 1182 singletons, was revealed. Based on blast searches, 882 (61.3%) genes had significant (E‐value <1e–5) matches to known sequences in public databases. Among them, >70 genes were involved in stress response, immunity and apoptosis. These results expanded our knowledge of the genetics and physiology of the Japanese scallop, and provided a useful resource for gene discovery for further research of this species.     

转录组学技术在水产动物研究中的运用

文章以大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织作为研究对象,利用RNA-seq技术进行转录本测序和数据分析,经拼接组装,最终获得35 659条unigenes,序列平均长度738 bp,序列长度中位数 (N50)为1 052 bp。另外从长度分布与GC含量等方面对unigenes进行评估,数据显示测序质量好、可信度高。使用6大数据库 (KOG、Nr、Pfam、Swiss-Prot、GO和KEGG) 注释大口黑鲈转录组unigenes,分别对应有15 832、21 279、14 524、16 973、15 024和11 185条unigenes获得注释。其中,5 617条unigenes在以上所有数据库中同时注释成功,17 253条unigenes至少被一个数据库注释。KEGG分析结果显示,获得注释的11 185条unigenes被划分到267个代谢通路中,参与信号转导通路的unigenes数量最多,共有1 349条(12.06%)。另外还检测到4 030个微卫星 (SSR)位点。通过对大口黑鲈转录组测序,获得了大量的转录组信息,为大口黑鲈的功能基因克隆、基因组学、遗传多样性分析、分子标记开发及遗传改良等研究奠定了基础。

     

正常与性早熟中华绒螯蟹的Y-器官转录组分析

性早熟是中华绒螯蟹养殖过程中普遍存在的一个问题。为发掘中华绒螯蟹性早熟相关的重要功能基因,实验采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术获得了正常与性早熟雌蟹的Y-器官转录组数据,并进行比较分析。结果显示,测序分别获得44 619 538和43 052 958个clean reads,比对发现2655个差异表达基因,Gene Ontology(GO)功能分类分析将文库中的差异表达基因归类到3大功能(生物过程、细胞组分和分子功能)的42个类别中。KEGG富集分析将文库中的差异表达基因富集到134条特定的KEGG代谢途径,其中4条是显著性富集,包括酮体合成和降解、丁酸甲酯代谢、神经营养因子信号通路和碱基切除修复通路。通过RNA-seq技术获得了丰富的中华绒螯蟹Y-器官转录组信息,为中华绒螯蟹新基因克隆、性早熟成因与预防和Y-器官的研究提供有价值的数据。     

Predation risk management of sea stars (Asterias amurensis and Distolasterias nipon) by adjusting the density and size of seeded scallops (Mizuhopecten yessoensis): an improvement to local mariculture

Optimizing the release density and size of juvenile commercial species for local ecosystems is a critical issue that should be considered when countering predation impacts. To ascertain whether mariculture production of the Japanese scallop (Mizuhopecten yessoensis) could be enhanced by modifying releasing practices, we experimentally investigated the effects of density and size of scallop seeds on their survival in the presence of two sea star species, Asterias amurensis and Distolasterias nipon, with different predation capacities. Under current mariculture practices, the juveniles are briefly exposed to air just before release; therefore, we also examined how air exposure stress increased the predation risk. Scallop survival in the presence of both sea stars increased by?>?20% by increasing scallop size from 30 to 50 mm. Increasing scallop density (range: 5 to 30 scallops m^?2) increased each individual’s survival in the presence of A. amurensis but had no significant effect on predation by D. nipon. Therefore, the release of smaller quantities of large-sized scallops rather than larger quantities of small scallops is recommended to reduce D. nipon predation. In the presence of sea stars, especially by D. nipon, the predation impact on small scallops increased after just a few hours of air exposure, indicating that air exposure of juvenile scallops should be minimized. Our results will mitigate the economic cost of mariculture by facilitating the determination of optimal release conditions for juvenile scallops.

     

低盐度养殖脊尾白虾试验

转录组测序可在各种环境条件下对物种进行高通量测序,通过基因结构分析和功能注释,探讨特定条件下相关基因的功能和表达情况。该研究分别获取低盐胁迫组 (盐度0.2) 和自然海水组 (盐度31) 脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 样品,通过Illumina平台进行转录组测序,获得13.92 Gb高质量测序数据,组装得到111 618条转录本和72 734条Unigenes,其中有22 879条Unigenes得到注释,比对到Nr数据库的Unigenes为21 931条;筛选出1 492条脊尾白虾低盐胁迫差异显著表达基因,包括829条上调基因和663条下调基因,其中有810条差异表达基因得到注释。通过差异表达基因GO功能注释和富集分析及KEGG通路富集分析,锁定大量脊尾白虾在自然海水和淡水环境下的差异表达基因,为深入探讨脊尾白虾在低盐胁迫条件下的生理保护机制提供了技术支撑。

     

基于转录组测序技术筛选花(鱼骨)卵巢发育相关基因

为筛选影响花■卵巢发育相关的基因,采用Illumina Hiseq技术对花■脑、卵巢和肝脏组织进行高通量转录组测序。结果显示,3个组织分别产生了49 484 132、47 540 538和50 622 304个clean reads,组装后共获得了99 878个unigenes,平均长度为1 430 bp。DE seq分析发现,在脑vs.卵巢组中特异性表达的基因数为2 305个,脑vs.肝脏组中特异性表达的基因数为839个,卵巢vs.肝脏组中特异性表达的基因数为1 474个,3个比较组共有的差异表达基因数为860个。GO分析发现,上述差异表达基因主要集中在初级代谢过程(primary metabolic process)、单细胞过程(single-organism process)、有机物代谢过程(organic substance metabolic process)等生物学过程中。KEGG pathway分析显示,一些与卵巢发育和减数分裂相关的信号通路得到了显著富集,如GnRH信号通路、类固醇激素合成、TGF-β信号通路、卵母细胞减数分裂等代谢通路。本研究结果丰富了花■的基因资源,可为花■的繁殖生物学研究提供基础数据。     

鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-3)诱导鲤肝组织自噬发生的研究

在鲤(Cyprinus carpio)感染鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-3)不同时期,通过分析鲤疱疹病毒标志基因TK和ORF72与自噬标志基因Beclin-1、LC3、P62的差异表达情况,探讨在CyHV-3感染中自噬的发生情况。研究表明:(1)抗病选育组与未选育组鲤TK和ORF72基因以及自噬标志因子Beclin-1、LC3、P62基因相对表达量均呈现先升高后降低的趋势; TK和ORF72基因相对表达量选育组均极显著低于未选育组(P<0.01)且在感染144 h达到最高;(2)选育组鲤Beclin-1、LC3、P62基因相对表达量在感染48h达到最高,且Beclin-1、LC3基因表达量极显著高于未选育组(P<0.001),P62显著高于未选育组(P<0.05);(3)未选育组鲤Beclin-1、LC3、P62基因相对表达量在感染96h达到最高且极显著高于选育组(P<0.001),而P62基因相对表达量持续在感染144h、192h极显著高于选育组(P<0.01),说明P62基因表达发生了聚集;(4) LC3蛋白表达趋势与基因相对表达量趋势一致。以上结果表明C...