RT-LAMP技术检测菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国对外公布的检疫性有害生物,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了一种快速、灵敏和特异的BPMV检测方法。根据BPMV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对BPMV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高1 000倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中60℃等温扩增,整个检测周期约2~2.5 h,适合BPMV的快速、准确检测。     

逆转录环介导等温扩增技术检测草莓潜隐环斑病毒的研究

采用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,建立了草莓潜隐环斑病毒（Strawberry latent ringspot virus, SLRSV）检测方法。根据SLRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过逆转录环介导等温扩增得到特征性的瀑布状条带。特异性试验表明,引物对SLRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP的灵敏度比普通RT-PCR高出100倍。该方法无需特殊的试剂和设备,只需在水浴锅中65 ℃等温扩增,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

 根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法.同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断.特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致.     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列，筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法 (加SYTO-9)和可视化方法 (加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明，优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10³ fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析，表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0 (1～1, 95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择，对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。     

南方菜豆花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

本研究针对南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)保守序列设计了特异性PRA引物,建立了快速灵敏的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测技术(RT-RPA),采用SBMV,BPMV,SMV,Ar MV和TRSV共5种病毒评价该方法的特异性,并对其灵敏度进行评价。结果显示,建立的RT-RPA方法特异性强;灵敏度达到0.1 ng。本研究建立的RT-RPA方法检测SBMV特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合实验室或者现场快速检测。     

沙地葡萄茎痘相关病毒的RT-LAMP检测方法

 本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus, GRSPaV）的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列（GenBank登录号：GQ478314）为靶序列,设计3组RT-LAMP引物,从中筛选出1组有效引物,并确定了适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行Hha Ⅰ酶切,酶切片段与理论片段大小一致,证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10^-4,与RT-PCR方法相比更为灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ （×1000）可直接观察反应结果。建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。     

橡胶树胶孢炭疽菌复合群LAMP检测方法的建立及应用

由胶孢炭疽菌复合群(Colletotrichum gloeosporioides species complex)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一。本研究以β-tubulin基因为靶标基因,设计橡胶树胶孢炭疽菌复合群特异性引物,以SYBR Green I为指示剂,建立了特异性强、灵敏度高的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,进行了室内侵染和田间自然发病样品的检测验证。结果表明,该方法能在63℃恒温条件下60 min内检测出病原菌,且能特异性识别我国主要植胶区的橡胶树胶孢炭疽菌。该方法最低检测限为1 pg DNA或100个分生孢子。室内和田间样品检测结果表明,该方法可同时检测出潜伏侵染期和发病期的胶孢炭疽菌。本研究建立的LAMP检测方法为橡胶树胶孢炭疽菌的快速鉴定提供了新技术。