绒山羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

该研究将20-45d的绒山羊胚胎生殖嵴及其邻近组织用机械剪和胰蛋白酶 EDTA消化处理，未加任何细胞生长因子。仅添加DMEM 10％犊牛血清，在38℃、5％CO2，饱和湿度条件下，将原始生殖细胞(PGCs)与其胎儿成纤维细胞共培养，在原代培养至1周左右时观察到了鸟巢状类胚胎干细胞(ES细胞)和集落团，贴壁生长于成纤维细胞层上面。经电镜观察，类胚胎干细胞体积小、核大，有多个核仁。细胞形态不规则，无明显界限等特点。     

从原始生殖细胞分离和克隆兔的胚胎生殖细胞

研究采用 1 4～ 1 8d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养 ,低糖DMEM +1 0 %NBS +1 0 %FCS +1 0ng/mLLIF +1 0ng/mLSCF+0 1mol/Lβ 巯基乙醇 +1 0 0U/mL青霉素 +80U/mL链霉素作培养基 ,分离出兔原始生殖细胞 (PGC) ,克隆并多次传代。从原始生殖细胞 (PGC)中获得胚胎生殖细胞 (EG)细胞集落 ,1 4d胎儿原代观察到类EG细胞集落 ,传至 4代后丢失。 1 6d胎儿的类EG只传 2代 ,1 8d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征 ,呈典型的团块状聚集生长 ,碱性磷酸酶 (AKP)染色呈阳性 ,在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等     

小鼠胚胎干细胞裂解液诱导鸡胚成纤维细胞发生重编程的研究

本研究采用小鼠胚胎干细胞(ESCs)裂解液与鸡胚成纤维细胞共孵育,通过形态学观察和多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液逆转化鸡胚成纤维细胞为多能干细胞的可行性。结果表明:与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,形成了42.33个细胞集落;经AKP染色以及Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应,表现出一定的多能干细胞特性;经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs特征的细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs裂解液。因此,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用能够在小鼠和鸡之间发生。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论:胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

<正>目的:探索不同浓度的丝裂霉素C(MMC)处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法:取13.5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3.5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度     

绵羊Nanog启动子克隆及其表达活性的检测

通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。     

蛋源无血清培养基培养鸡类囊胚和鸡、人成纤维细胞的研究

试验采用新鲜种蛋(A0组)和无精蛋(B0组)蛋清培养基培养鸡类囊胚、鸡成纤维细胞和人成纤维细胞；比较了以类囊胚形式存在的鸡胚胎干细胞和鸡成纤维细胞、人成纤维细胞在利用蛋清组分上的区别。结果显示：(1)与B0组相比,A0组培养的类囊胚和鸡成纤维细胞表现出了生长优势,而这点在人成纤维细胞没有体现。(2)类囊胚形成期集中利用蛋白质,其中卵清蛋白的相对量下降最快；人成纤维细胞的蛋清培养液中胰蛋白酶抑制剂显著下降,且也发生在培养早期；鸡成纤维细胞的培养液组分在整个过程中都无显著变化。     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素

为了研究影响胚胎干细胞(ESC)体外分离克隆的因素,试验采用3~5日龄大鼠心肌细胞制成心肌细胞条件培养基(RH-CM),比较了4种培养体系对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响,并分析比较了不同饲养层对胚胎干细胞分离克隆造成的影响。结果表明:添加重组鼠白血病抑制因子和心肌细胞条件培养基在胚胎贴壁率、内细胞团(ICM)形成率和原代胚胎干细胞集落形成率以及抑制分化的过程中起到的作用显著优于未添加任何诱导成分的培养基;作为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养胚胎干细胞的效果优于小鼠睾丸支持细胞(MS)。     

绵羊Oct4基因启动子的表达活性分析

Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。     

肝脏细胞和胰腺细胞的发育与再生

肝脏和胰腺前体细胞都是由胚胎前肠内胚层细胞发育而来的。脊椎动物中,在高度保守的诱导信号和遗传调节因子作用下,肝脏和胰腺前体细胞特化,并获得器官功能和再生能力。由于对肝脏疾病和Ⅰ型糖尿病有重要的临床价值,肝脏、胰腺的发育和再生机制成为了研究热点。通过对不同模式生物的研究,揭示了进化上保守的诱导信号和转录因子诱导肝脏、胰腺细胞的分化机制,这为干细胞和前体细胞如何诱导分化为肝实质细胞和胰腺β细胞提供了理论依据。     

牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养

分离培养牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的目的是克服体外受精中早期胚胎发育阻断,建立有利于牦牛早期胚胎体外发育的共培养体系.采集牦牛输卵管上皮细胞进行原代及传代培养,同时从卵泡液中获取颗粒细胞进行原代培养,培养过程中观察2种细胞的生长方式和形态特点.输卵管上皮细胞贴壁生长时,呈多边形,且呈单层成簇生长.培养144 h～216 h,可形成细胞单层.颗粒细胞贴壁生长时,呈现聚集生长特性,贴壁细胞形状不规则,呈放射状.培养72 h～96 h,形成颗粒细胞单层.     

Resident Dendritic Cells in the Epidermis: Langerhans Cells, Merkel Cells and Melanocytes

Résumé— En plus des kératinocytes, l'épiderme contient des cellules résidentes de morphologie dendritique. Ce sont principalement la cellule de Langerhans, la cellule de Merkel et le mélanocyte. Ces cellules ont des fonctions diverses dans le tégument. Le mélanocyte assure la pigmentation cutanée et la protection contre les radiations U.V., et pourrait intervenir également dans la modulation de l'inflammation cutanée. La cellule de Langerhans intervient dans la surveillance immunologique des surfaces corporelles ecternes. La cellule de Merkel a des fonctions neuroendocrines. Cet article donne un aperçu de la structure et de la fonction de ces trois importantes populations cellulaires dans la peau. [Resident dentritic cells in the epidermis: Langerhans cells, Merkel cells and melanocytes (Cellules dentritiques résidentes de l'épiderme: cellules de Langerhans, cellules de Merkel et mélanocytes). Resumen— La epidermis contiene, además de los queratinocitos, células résidentes de morfologia dendria dendritica. Estas son principalmente las células de Langerhans, las células de Merkel y los melanocitos. Estas células tienen varias funciones en el integumento. Los melanocitos se encargan de la pigmentación y protección de la piel contra la radiación ultravioleta y tarrtbién participan en la regulación de la inflamación cutánea. Las células de Langerhans ayudan en la regulación inmunológica en la superficie externa. Las células de Merkel tienen funciones neuroendocrinas. Esta revisión da un repaso general a la estructura y función de tres importantes células de la piel. [Resident dendsuitic cells in the epidermis: Langerhans cells, Merkel cells and Melanocytes (Células résidentes en la epidermis: células de Langerhans, células de Merkel y melanocitos). Abstract— In addition to the keratinocytes, the epidermis contains resident cells of dendritic morphology. These are principally the Langerhans cell, Merkel cell and melanocyte. These cells have a number of different functions in the integument. The melanocyte is responsible for skin pigmentation and protection against UV radiation, and may also play a role in the modulation of cutaneous inflammation. The Langerhans cell aids in the immunological monitoring of the body's external surfaces. The Merkel cell has neuroendocrine functions. This review gives an overview of the structure and function of these three important cells of the skin.     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞及胎儿成纤维细胞的培养

本文培养了猪输卵管上皮细胞、颗粒细胞、耳上皮细胞、胎儿成纤维细胞等几种细胞 ,比较了几种细胞原代和传代培养的特点 ,发现原代培养时猪耳组织、胎儿组织消化后的单细胞和剩余细胞团块一起培养 ,其生长速度较单个细胞快。 4种细胞中颗粒细胞体积最大 ,生长速度最慢 ,传代密度须保持 2× 10 5 ml以上为宜。     

胰腺干细胞分化为胰岛细胞的诱导方法

糖尿病作为全球范围内的代谢性常见疾病,严重影响着患者的生命质量。常规的药物和胰岛素注射并不足以根治糖尿病。近年来,逐渐发展起来的干细胞的相关研究,有望从根本上治愈糖尿病及其并发症,因而成为治疗糖尿病的研究热点。而利用干细胞医治糖尿病的关键点是明确干细胞的来源及分化为胰岛细胞的诱导方法。论文针对胰腺干细胞存在部位及诱导方法的研究概况做一综述。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×104个细胞/mL)、2组(1×105个细胞/mL)、3组(1×106个细胞/mL)、4组(1×107个细胞/mL)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察.结果显示,4组复苏后死亡率极显著低于其他3组(P＜0.01),贴壁率显著高于其他3组(P＜0.05);3组细胞凋亡率显著低于其他3组(P＜0.05);3、4组细胞到第3天基本铺满瓶底,生长状态良好.     

体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究进展

诱导多能干( induced pluripotent stem,iPS)细胞在维持多能的同时能够持续自我更新。由于诱导多能干细胞能够创造病人特异或者疾病特异的多能干细胞,这些细胞对于研究疾病的机理和药物的发现非常有用。作者主要从iPS细胞建立的优化、被重编程的细胞类型、iPS细胞的发育潜能、iPS细胞产生的2种模型及iPS细胞的应用等5个方面进行了综述。