三倍体湘云鲫及其亲本线粒体DNA的比较研究

用人工选育的异源四倍体鲫鲤（♂）与白鲫（♀）杂交获得具有明显生长优势的三倍体湘云鲫。采用差速离心和核酸酶处理等方法，从三倍体、白鲫和异源四倍体鲫鲤肝组织中提取线粒体DNA，并用9种限制性内切酶进行单酶酶切分析。经琼脂糖凝胶电泳后计算出各酶切片段的大小，测得三倍体、白鲫和异源四倍体鲫鲤mtDNA的分子大小分别为16．24kb、16．60kb和16．20kb。根据各单倍型间的酶切片段共享度，估算出3个群体间的遗传距离，说明了mtDNA母系遗传的特性。     

条纹斑竹鲨线粒体DNA的研究

用6种限制性内切酶分析了4条条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)的线粒体DNA(mtDNA)。PstI、HpaI、XbaI、EcoRI、EcoRV、BaI Ⅱ在条纹斑竹鲨mtDNA分子上分别具有0至2个切点,mtDNA分子大小为16.6kb,根据单酶和双酶完全酶解片段的大小,构建了条纹斑竹鲨mtDNA的限制性酶切图谱。     

建鲤线粒体DNA的遗传多态性初步分析

用16种限制性内切酶对建鲤mtDNA进行酶解分析,结果表明：建鲤的mtDNA分子大小约为16.6kb;除Bgl Ⅱ无切点,ClaⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XhoⅠ有一个切点外,其余11种酶都有2个或2个以上酶切位点,其中DraⅠ、PvuⅡ检出mtDNA多态,将建鲤mtDNA分为两种不同的单倍型;计算建鲤种内（群体内）mtDNA多态值π＝0.00164。建鲤在分子水平显示出的遗传多样性,可能是建鲤能够适应全国各地的环境条件和养殖方式,并得以大规模推广的重要原因之一。     

东昌湖野生鲤的线粒体DNA RFLP分析

利用差速离心法及RNase消化法制备并纯化了采自山东东昌湖野生鲤（Cyprinus carpio haematopterus）的肝脏及性腺线粒体DNA,用7种限制性内切酶对其mtDNA进行酶解,经琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段,用Gel-5000凝胶图像分析系统进行采集和分析。结果显示,东昌湖野生鲤的mtDNA分子大小为（16.62±0.15）kb,BglⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ的酶切点分别为3或2、1、3或4、4、1、0、3;其中,BglⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ     

东昌湖野生鲤鱼线粒体DNA RFLP分析

利用差速离心法及RNase消化法制备并纯化了采自山东东昌湖野生鲤(Cyprinus carpio haematopterus)的肝脏及性腺线粒体DNA,用7种限制性内切酶对其mtDNA进行酶解,经琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段,用Gel-5000凝胶图像分析系统进行采集和分析。结果显示,东昌湖野生鲤的mtDNA分子大小为(16.62±0.15)kb,BglⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ的酶切点分别为3或2、1、3或4、4、1、0、3;其中,BglⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ内切酶具有限制性多态性,多态酶比例为42.86%,并检测出12个限制性态型,可归并为5种单倍型,各单倍型间的遗传距离0.0075～0.0365,揭示了东昌湖野生鲤存在较高的种内多态性。试验结果与以前报道的其他地区鲤属线粒体DNA酶切结果相比较,表明鲤属mtDNA在限制性酶切位点数量及其长度上存在地域差异。     

5种常见石斑鱼的线粒体DNA酶切物理图谱

用识别5、6碱基序列的17种限制性内切酶,即BamHⅠ、BglⅠ、BglⅡ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、KpnⅠ、MluⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、SmaⅠ、StyⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ,对南海海域石斑鱼属(EpinephelusBloch)野生蜂巢石斑鱼(E.merra)、鲑点石斑鱼(E.fario)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和七带石斑鱼(E.septem-fasciatus)的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析。测算出蜂巢石斑鱼、鲑点石斑鱼、青石斑鱼、赤点石斑鱼和七带石斑鱼的mtDNA分子大小分别为(18.52±0.21)kb、(18.44±0.21)kb(、18.56±0.18)kb、(18.57±0.19)kb和(18.36±0.11)kb。通过单、双酶切分析,分别构建了蜂巢石斑鱼10种酶共20个酶切位点、鲑点石斑鱼9种酶共17个酶切位点、青石斑鱼8种酶共16个酶切位点、赤点石斑鱼7种酶共12个酶切位点和七带石斑鱼7种酶共13个酶切位点的酶切物理图谱。BglⅡ和XhoⅠ两种内切酶的酶切谱带可作为鉴别这5种石斑鱼的RFLP标记。     

尼罗非鲫和奥利亚非鲫线粒体DNA遗传差异的研究

以酶切MitochondrialDNA（mtDNA）技术检测了尼罗非鲫和奥利亚非鲫的mtDNA。测得两种鱼线粒体基因组的大小都约为16．83kb。在使用的6种酶中，只有PvuⅡ在所检测的15尾尼罗非鲫mtDNA上产生了多态片段，3尾鱼的mtDNA产生了4个片段，12尾鱼的mtDNA产生3个片段。而6种酶在所有15尾奥利亚非鲫中均未检到多态片段。比较两种鱼的mtDNA酶切片段，仅PvuⅡ的酶切结果有所不同，尼罗非鲫mtDNA上有3个或4个PvuⅡ位点，但奥利亚非鲫mtDNA上有5个位点，因此，PvuⅡ的酶切位点可作为鉴别它们的分子遗传标记。     

鲇鱼线粒体DNA的酶切图谱

采用差速离心法及ＤＮａｓｅⅠ、ＲＮａｓｅ消化法制备并纯化了鲇（Ｓｉｌｕｒｕｓａｓｏｔｕｓ）肝脏线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）。用８种限制性内切酶对ｍｔＤＮＡ进行了分析。ＢｇⅡ、ＥｃｏｒⅠ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＸｂａⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ在鲇ｍｔＤＮＡ分子上分别具１、１、１、２、２、７、７和０个切点。ｍｔＤＮＡ分子量约１０．８４×１０￣６道尔顿，大小为１７．５４ｋｉｌｏｂａｓｅｐａｉｒｓ。根据单酶和双酶解片段的数目和分子量，建立了鲇ｍｔＤＮＡ的限制性酶切图谱。     

鲇（Silurus asotus L．）线粒体DNA的初步研究

实验共用13种限制酶分别对鲇mtDNA作酶切分析。其中，酶BamHI、Bgll和Sacl在鲇mtDNA分子上产生2个切点；BglⅡ、EcoRⅠ、PstⅠ和ScaⅠ都产生1个切点；HindⅢ和PvuⅡ分别产生5个和3个切点；XbaⅠ的切点多于5个，而ClaⅠ、DraⅠ和KpnⅠ没有切点。根据酶解结果计算出鲇mtDNA的大小     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的RAPD分析

在优化RAPD检测条件的基础上，从100个随机引物中筛选出60个扩增较好的引物对异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和湘江野鲤相互间扩增DNA片段的异同性进行比较研究。结果显示，60个引物共产生1554条带，单一引物扩增的DNA片段数在6～20条之间，片段大小在200～3500bp之间。遗传相似率分析表明，异源四倍体鲫鲤与其原始母本红鲫的相似率为69．41％，与其原始父本野鲤的相似率为64．47％，说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本红鲫的遗传物质要多一些；而红鲫和野鲤之间的相似率为42．18％，说明两者的基因组成有较大的相似性，从分子水平证实了红鲫和野鲤的远缘杂交具有较大的亲和性。在分析中，还发现异源四倍体鲫鲤有4条非亲本带，非亲本带谱率达0．72％，这些非亲本带可以作为异源四倍体鲫鲤特异性的分子标记。     

方正银鲫、白鲫与鲫线粒体DNA限制性内切酶酶切比较

用 Bam HI、Eco RI、Dra I、Hinf I、Hind III、Hpa II、Msp I、Pst I、Sau 3AI、Sma I、Xba I、Xho I和 Sal I等十三种限制性内切酶对方正银鲫(Carassius aur-atus gibelio)、白鲫(Carassius auratus cuvieri)和鲫(Carassius auratus auratus)的线粒体 DNA(mt DNA)进行单酶酶切以及其中八种识别六碱基对序列的限制性内切酶的双酶酶切,经琼脂糖凝胶电泳后,分析且计算出各酶切片断大小,得出三种鲫鱼的 mt DNA分子大小:方正银鲫为 15990±90碱基对(bp);白鲫为 16600±130碱基对(bP);鲫为 15540±140碱基对(bp),并且分别建立了方正银鲫、白鲫和鲫 mt DNA由 Bam HI、Pst I、Eco RI 及 Xba I等四种限制性内切酶构建的酶切图谱。     

红鲫(♀)×湘江野鲤(♂)F2和F3的染色体研究

采用血细胞培养制片法和肾脏细胞直接制片法对红鲫(♀)×湘江野鲤(♂)杂交种F2和F3代的染色体数目和核型进行了比较分析，得出F2代染色体数目为100条，染色体组型为22m＋34sm＋22st＋22t，NF＝156；F3代染色体数目为4n＝200，染色体组型为44m＋68sm＋44st＋44t，NF＝312。为证明红鲫×湘江野鲤杂交后代由异源二倍体转变为异源四倍体发生于F2与F3代之间提供了直接证据。     

红鲫(♀)×湘江野鲤(♂)F_2和F_3的染色体研究

采用血细胞培养制片法和肾脏细胞直接制片法对红鲫 (♀ )×湘江野鲤 (♂ )杂交种F2 和F3 代的染色体数目和核型进行了比较分析 ,得出F2 代染色体数目为 10 0条 ,染色体组型为 :2 2m 34sm 2 2st 2 2t ,NF =156;F3代染色体数目为 4n =2 0 0 ,染色体组型为 :4 4m 68sm 44st 44t ,NF =312。为证明红鲫×湘江野鲤杂交后代由异源二倍体转变为异源四倍体发生于F2 与F3代之间提供了直接证据。     

鲢鳙线粒体DNA的九种限制性内切酶酶场图谱的比较

以十一种限制性内切酶对鲢鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解的切点数：ＳａｌＩ和ＢｇｌⅡ为０；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＫｐｎＩ和ＳａｃＩ为１；ＨｐａＩ和ＸｂａＩ为２；ＢａｍＨＩ为３；ＢｇｌＩ和ＥｃｏＲＩ为４。以九种限制性内切酶对鳙鱼ｍｔＤＮＡ进行单酶完全酶解，其切点数；ＰｓｔＩ．ＸｈｏＩ．ＳａｌＩ．ＫｐｎＩ．ＢｇｌⅡ均为１；ＨＰａＩ和ＸｂａＩ为２；ＳａｃＩ为３；ＢｇｌＩ为４。采用琼脂糖凝胶电泳法测得鲢鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１５９３０±２２０碱基对（ｂｐ）；鳙鱼ｍｔＤＮＡ分子量为１６６５０±１５０碱基对（ｂｐ）。用单、双酶解法和部份酶解法构建了鲢鱼九种酶１８个切点和鳙鱼九种酶１６个切点的限制性内切酶酶切图谱。另外，对这两种鱼的酶解位点数，片段大小和限制酶图谱进行了比较。     

州河鲤、建鲤和框鳞镜鲤的mtDNA D-loop的RFLP分析

应用PCR技术扩增了州河鲤、建鲤以及框鳞镜鲤mtDNA的D-loop区段,并用13种限制性内切酶对扩增到的片段进行了分析。结果显示:在3种鱼分别扩增到的约1.6kb的DNA片段上,13种限制性内切酶中有8种(AluⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ、HaeⅢ、HapⅡ、HinfⅠ、TaqⅠ和XspⅠ)有酶切位点,4种(DraⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ和XspⅠ)个体间存在变异。不同酶切结果组合后,共得到6种单倍型。州河鲤中以单倍型Ⅲ为主,达91.37%,建鲤以单倍型Ⅵ为主,达81.25%;框鳞镜鲤中单倍型Ⅱ占39.47%,单倍型Ⅲ占47.37%;州河鲤、建鲤以及框鳞镜鲤群体内的单倍型多样性指数(h)和核苷酸多样性指数(π)分别为0.1603、0.3327,0.6287、0.003042,0.004838、0.007163。州河鲤与框鳞镜鲤间的Rogers遗传距最小,为0.4080;州河鲤与建鲤间的为0.8440;框鳞镜鲤与建鲤间的为0.6469。     

乌鳢线粒体DNA限制性内切酶酶切分析

用BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅡ,HinfⅠ,MspⅠ,PstⅠ,SmalⅠ,XhoⅠ,DraⅠ,SalⅠ等十种限制内切酶对纯化后的乌鳢(Ophiocephalus argus)线粒体DNA(mtDNA)进行酶切,然后用电泳技术分离酶切片段。结果表明,十种限制性内切酶只有DraⅠ,SalⅠ两种限制性内切酶有多个酶切位点,且计算出乌鳢mtDNA大小约由17200个碱基对组成。     

条纹斑竹浙江省鲨线粒体DNA的研究

用６种限制性内切酶分析了４条条纹斑竹鲨的线粒体ＤＮＡ，ＰｓｔＩ，ＨｐａＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＶ，ＢｇｌⅡ在条纹斑竹鲨ｍｔＤＮＡ分子上分别具有０至２个切点，ｍｔＤＮＡ分子大小为１６．６ｋｂ，根据单酶和双酶完全酶解片段的大小，构建了条纹斑竹浙江省ｍｔＤＮＡ的限制性酶切图谱。     

中国红鲤四群体线粒体DNA遗传多样性、起源及分化

用13种限制性内切酶对兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤及瓯江彩鲤4种红鲤的线粒体DNA(mtDNA)进行RFLP分析。共产生17种限制性态型,其中5种酶为限制性片段长度多态性(RFLPs),归结为5种单倍型;兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤和瓯江彩鲤的核苷酸多样性(Ⅱ)分别为0．0087、0．0059、0．0094、0．0286,瓯江彩鲤的遗传多样性最为丰富;瓯江彩鲤起源于单倍型Ⅱ为主的母系祖先,推算分化时间分别约在11．5万年、9．5万年前;玻璃红鲤和荷包红鲤起源于单倍型I为主的母系祖先,推算分化时间分别约为5～5．6万年、2万年前。     

蛋白磷酸酶PP-1c在不同倍性鱼6种组织中的分化表达模式

以异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本(湘江野鲤/红鲫)和子代三倍体湘云鲫等为实验材料,运用Western-blotting技术及荧光免疫组织化学技术等实验手段,分析了PP-1的催化亚基在上述不同倍性鱼体内的表达模式：蛋白水平检测发现PP-1c在不同倍性鱼的大脑、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和性腺6种主要器官组织中均有表达,且不同的组织中显示了明显的差异表达模式,而PP-1c在这4种不同鱼的肌肉组织中的表达差异更显著,其中在异源四倍体鲫鲤中表达最低,在父/母本红鲫中的表达水平相对较高,子代三倍体湘云鲫中的表达最高,这种差异性可能从生化的角度说明了子代与父母本之间的变异性。免疫荧光组化实验结果显示,从整体水平来看,4种不同鱼的同一组织中,PP-1c的表达模式是非常相似的,这可能从蛋白和细胞的水平说明了异源四倍体鲫鲤与其二倍体父/母本及子代三倍体湘云鲫之间的遗传相似性。但对于同一组织的不同细胞的具体表达部位是有差异的,具有细胞特异性。     

两种笛鲷线粒体DNA物理图谱的构建

取星点笛鲷(白星笛鲷LutjanusstellatusAkuzaki)和千年笛鲷(L.sebaeCuvieretValenci-ennes)肝脏组织,分离纯化其线粒体DNA(mtDNA),用限制性内切酶分析构建了两个种mtDNA的物理图谱,进行了限制性片段长度多态性分析,得到两个种的分歧时间大约为5.1Ma(取序列进化率为每百万年1.5%),发现4种内切酶(BglⅠ、MluⅠ、KpnⅠ、SalⅠ)酶切位点在两种间存在明显差异。这些差异为区分两个种提供了遗传标记,同时也为笛鲷类进化遗传学的研究和育种提供了资料。