巴西固氮螺菌中杂合双组分蛋白Org35与NifA的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可以与玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)等重要作物联合固氮,是重要的潜在生物肥料.NifA蛋白是所有固氮基因转录所必需的激活蛋白.本研究利用融合蛋白下拉分析,探讨了Org35蛋白与NifA蛋白的相互作用.研究表明二者存在互作.Org35蛋白由3个独立结构区域组成,即PAS结构域、组氨酸蛋白激酶结构域和应答调节蛋白区域.本研究采用融合蛋白下拉分析了Org35蛋白三个结构域与NifA的互作关系,结果表明Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

固氮粪产碱菌nifH基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析

采用＾３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＨ ＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同ＮＨ４＾＋浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因在粪产碱菌结合子中的β－半乳糖苷酶活性，结果证明该融合基因的表达受     

固氮粪产碱菌中nif,ntr和gln基因鉴定及nifA克隆

本工作采用＾３２Ｐ标记的与固氮（ｎｉｆ）和一般氮代谢（ｎｔｒ和ｇｌｎ）系统有关的基因探讨，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤＫ、ｎｔｒＡ，ｎｔｒＣ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ同源的ＤＮＡ序列。以Ａｚｏｓｐｉｒｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＡ ＤＮＡ为探针，经三轮杂交筛选。     

固氮细菌氮调节系统（ntr和gln）的基因组成及调控机制（综述）

固氮基因的表达受氮调节系统ｍｉｆＡＬ操纵子的调节控制。ｎｔｒＣ在氮调节和固氮基因表达过程中起关键作用。本文阐述了氮调节系统的基因组成，作用机制和研究进展，并讨论了在联合固氮菌中氮调节基因的作用及工程固氮菌构建的可能途径。     

固氮粪产碱菌ntrC基因的表达及固氮调节功能研究

采用双亲结合方法，将粪产碱菌Ａ１１５０ｌｎｔｒＣ和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因转入Ａ１５０１中，获得携带双拷贝ｎｔｒＣ的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）和ｎｔｒＣ－ｌａｃＺ融合基因的结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ２）。在微好氧条件下，当铵为６ｍｍｏｌ时结合子Ａ１５０１（ｐＬＡＣ１）仍保持３４．８％的固氮活性，表明在粪产碱菌中ｎｔｒＣ具有固氮正调节功能。在不同铵、氧、ｐＨ和盐浓度等条件下测定结合子Ａ１５０１     

nifH—lacZ融合基因在粪产碱菌中及联合固氮条件下的表达调节

将巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ转入粪产碱菌Ａ１５０１中，β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性测定结果表明，该转录型融合基因ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ在Ａ１５０１中的表达为诱导型的，在固氮条件下高水平表达，在高铵好氧下低水平表达，在无铵好氧下部分表达。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明在粪产碱菌中存在ｎｉｆＡ、ｒｐｏＮ和ｎｔｒＣ基因的同源序列，表明粪产碱菌ｎｉｆＨＤＫ的转录启始可能为ＮｉｆＡ和α＾５４依赖型的。携     

一个新的巴西橡胶树胶乳UEP基因的克隆与表达分析

在成功构建乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,我们克隆了巴西橡胶树胶乳UEP（ubiquitin extension protein）基因的cDNA全长序列。结构分析表明,该基因cDNA全长771bp,拥有一个468bp的开放阅读框架,77个核苷酸的5`UTR和226个核苷酸的3`UTR,编码156个氨基酸;Southern blot检测结果显示,UEP基因在巴西橡胶树基因组中属低拷贝基因。胶乳UEP基因的表达受到乙稀利的调节。在乙烯利处理后的24小时内,12小时收集的胶乳中UEP基因表达最强,对照和处理6小时的胶乳中表达最弱。乙烯利刺激可以促进巴西橡胶树胶乳增产和加速乳管衰老。这一结果暗示,UEP基因可能参与了乙烯利刺激巴西橡胶树胶乳增产或加速乳管衰老程的分子调控。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

巴西橡胶树Polyubiquitin基因5''调控序列的克隆及分析

利用GenomeWalker的方法获得了巴西橡胶树Polyubiquitin基因的5'调控序列，序列分析表明，在第一个Ubiquitin的起始密码子前含有1个内含子，内含子含有1175bp,A T含量为71.1%，另外存在TATAbox，CAATmotif,Gbox,HSE以及TCA-like等一些调控元件和1个约含230bp的A T含量丰富（90%）的区域。     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）exoC基因的克隆及其特性

应用Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｓｐ７的ｅｘｏＣ基因为探针，发现Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１具有与Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｅｘｏＣ基因同源的基因。Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｅｘｏＣ基因能恢复Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＥＰＳ缺陷型（ＥＰＳ＾－）突变，表明粪产碱菌ＥＰＳ的产量为ｅｘｏＣ基因产物所调控。本工作已获得类似Ａ．ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７的ｅｘｏＣ－ｌｉｋｅ基因的克隆     

Agronomical Performance of Upland Rice Cultivars Inoculated with Azospirillum brasilense Depends on the Plant Genotype

Plant growth–promoting bacteria may play an important role on rice development; however, its interaction with different genotypes is still uncertain. This work aimed to assess the effect of inoculation of Azospirillum brasilense AbV5 strain on the agronomical performance of different rice cultivars under field conditions during two consecutive years and to determine the response of rice cultivars to indole-acetic acid (IAA) rates under in vitro conditions using for both conditions a randomized block design. Field experiments evaluated the productivity components and grain yield of inoculated and noninoculated cultivars and in vitro assays monitored the plantlet growth under different IAA rates. Field experiments showed that the general average grain yield of rice cultivars inoculated with A. brasilense AbV5 strain was significantly greater. Fifty percent of the evaluated cultivars had statistically significant increase in yield varying from 40 to 108 percent upon inoculation with A. brasilense AbV5 strain, while 35 percent showed no significant change in yield (?6 to ?28 percent). In vitro assays showed rate- and cultivar-dependent responses of upland rice to exogenous IAA. These results show a cultivar-dependent response of rice to inoculation with A. brasilense AbV5 strain, which can be related with IAA production by AbV5 strain.     

Effects of Single and Combined Inoculations with Azospirillum brasilense and Trichoderma harzianum on Seedling Growth or Yield Parameters of Wheat (Triticum vulgaris L., Giza 168) and Corn (Zea mays L., Hybrid 310)

Inoculation of wheat and corn grains with formulations of Azospirillum brasilense significantly increased seedling growth parameters of wheat and corn compared to untreated controls. Inoculation with Azospirillum and supplemental Trichoderma harzianum free or coimmobilized in calcium alginate resulted in significant increase in all plant growth parameters in addition to improving plant nutrient-content [phosphorus (P), potassium (K), and calcium (Ca)]. Grain treatments with T. harzianum alone or in a combination with A. brasilense were protected from invasion by Fusarium in a pot experiment. Nitrogen (N) fixation was investigated by A. brasilense free or double inoculated with T. harzianum in soil amended with different C-sources; also, phosphate solubilization was tested by these two organisms. Single and double inoculation with A. brasilense and/or T. harzianum improved wheat yield growth parameters in addition to seed protein; therefore, immobilized and coimmobilized formulations could be used as biofertilizer and biopesticide, and might be recommended to avoid the extensive use of the agrochemicals.     

根瘤菌结瘤基因的表达调控研究概况

根瘤菌结瘤基因的表达调控在根瘤菌与植物的共生结瘤过程中起着十分重要的作用。随着研究的深入,发现根瘤菌的结瘤过程不仅与根瘤菌结瘤基因表达调控有关,而且与寄主植物的信号分子如黄酮类物质有关。根瘤菌结瘤基因的表达调控有一个复杂的过程,本文将简要地介绍这方面的研究成果。     

花生种子芽期耐低温相关基因克隆

利用GeneFishing技术获得耐低温花生品种花育44号种子在常温与低温诱导下的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)ACP20和ACP2。BLAST比对后发现ACP20基因与花生油质蛋白基因同源性达99%,ACP2基因与花生nifU-like(铁硫簇蛋白)蛋白mRNA同源性达99%,说明油质蛋白和nifU-like蛋白可能与花生对低温逆境胁迫的抗性有关。通过RACE技术从该品系获得相关基因的完整编码区,对其进行生物学功能预测,为探讨花生耐低温分子机制乃至培育耐低温花生新品种奠定了基础。     

SON-PCR扩增抗禾谷孢囊线虫基因LRR区及序列分析

根据与抗禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)基因Cre3的NBS(nucleotide binding site)编码区高度同源的Rccn4 序列设计3条3'端嵌套引物,采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法从含有源于易变山羊草(Aegilops varibilis)的抗禾谷孢囊线虫基因的小麦(Triticum aestivum)-易变山羊草染色体小片段易位系E-10中获得了长度为1264 bp的Rccn-L(GenBank登录号为DQ124933)，它将Rccn4 3'端延伸了1209 bp,编码区长1026 bp，含一个不完整的开放阅读框,一个终止密码子，没有起始密码子和内含子结构。其编码一个342个氨基酸残基的蛋白质，含有NBS(nucleotide binding site)-LRR(leucine-rich repeats) 类抗性基因LRR区的保守模体,呈现XXLXXLXXL重复。首次将SON-PCR方法成功地运用到植物基因组学研究中，为植物基因克隆又提供一方法。     

早酥梨病程相关基因非表达子1基因（NPR1）克隆及原核表达

本研究以成年早酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Zaosu)叶片为材料,通过RT-PCR克隆早酥梨病程相关基因非表达子1基因(NPR1)并获得其全长序列1771 bp,开放阅读框为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号:FJ769372).利用NCBI/Blastp和ClustalX软件进行相似性分析表明,目的基因编码蛋白质序列与日本梨(p.pyrifolia)、秋子梨(P.ussuriensis)、苹果(Malus xdomestica)、烟草(Nicotiana tabacum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NPR1蛋白相似性分别为99%、98%、98%、67%和59%.将其连接pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(EScherichia coli)BL21,经IPTG诱导表达获得大小约为91 kD的目的融合蛋白,融合蛋白主要以包涵体形式表达,表达量约占总蛋白17%.     

毛白杨叶绿体基因启动子和终止子的克隆及其功能鉴定

摘 要：从毛白杨(Populus tomentosa)无性系植株组培苗中提取基因组总DNA，通过合成3对特异性引物，用PCR的方法扩增了包含psbA基因启动子、终止子和16S rRNA基因启动子的叶绿体DNA序列。用BLAST及DNAMAN对克隆序列进行了分析，并结合前人的研究工作，确定了两个启动子Prrn、PpsbA的-35区、-10区以及翻译调控序列等重要调控序列元件和终止子的“TAA”序列。并在序列分析的基础上合成新的引物，准确克隆了毛白杨的叶绿体16S rRNA基因启动子Prrn、psbA基因启动子PpsbA及其终止子TpsbA。利用叶绿体基因启动子的原核表达特性，分别用启动子Prrn（其后添加rbcL基因的RBS序列）和PpsbA及终止子TpsbA分别构建了GFP基因的原核表达载体pSGmT、pPGmT，并以T7启动子为对照构建了GFP基因的原核表达载体pETGm，进行了初步的原核表达实验，检测结果表明：克隆到的叶绿体基因启动子和终止子是有生物学功能的，在大肠杆菌BL21中呈组成型表达，同时还证明了RBS序列在基因表达中的重要性。     

链霉菌(Streptomyces ST66)MalQ基因克隆与原核融合表达

利用PCR方法获得Streptomyces ST66 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pTrc-CKS中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的Streptomyces coelicolor MalQ基因的同源性高达97%。重组质粒pTrc-MalQ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Top10F',经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与CKS(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)基因表达的融合蛋白在目标位置约106kD处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

芒果AP1同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个A州同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl—1（GenBankac—cession No．FJ529206）和MAPl—2（GenBankaccession No．FJ529207）。MAPl—1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741bp,蛋白质分子量为28．54kD,等电点为8．31;MAPl—2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744bp,蛋白质分子量为28．78kD,等电点为8．70。同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物A纠同源基因的一致性为72％～81％。实验分析表明,MAPl—1和MAPl—2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异。蛋白二级结构预测显示,MAPl—1蛋白有12个α-螺旋,4个8折叠区,14个β-转角;而MAP1—2蛋白有11个α-螺旋,5个B折叠区,15个β-转角;其大多数氨基酸具有亲水性。本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段。