农杆菌介导的番茄遗传转化体系优化研究

    研究不同的番茄基因型、培养基类型、苗龄、外植体类型、植物表达载体和选择系统等对番茄再生和遗传转化效率的影响.结果表明,7 d苗龄的子叶或13 d苗龄的下胚轴,预培养2 d,侵染20 min,培养基中添加适宜浓度的玉米素(1.0～2.0 mg·L-1)和IAA(0.1～0.2 mg·L-1),以75～100 mg·L-1的卡那霉素筛选,番茄的转化频率最高,分别为51.4%和37.5%.且以卡那霉素抗性基因为筛选标记的质粒p2301 和pBI121作为植物表达载体,其转化频率高于以潮霉素抗性基因为筛选标记的植物表达载体p1301.     

农杆菌介导的番茄遗传转化体系优化

以番茄自交系AC++和番茄母本材料1448的子叶为外植体,采用农杆菌介导的方式接种于含有不同浓度玉米素(ZT)、吲哚-3-乙酸(IAA)和硝酸银(AgNO_3)的MS培养基上,以筛选适合番茄自交系AC++和1448的最佳遗传转化体系。结果显示,诱导愈伤组织及不定芽分化的最适培养基为MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO_3;诱导生根的最适培养基为1/2 MS+0.3 mg/L IAA。     

农杆菌介导的木薯遗传转化体系的优化

以木薯腋芽为外植体,通过添加不同含量的2,4-D和picloram摸索诱导体细胞胚及FEC的最佳激素条件;利用优化的再生体系,以木薯脆性胚性愈伤组织(FEC)为受体,对农杆菌侵染FEC的侵染浓度、侵染时间以及侵染后潮霉素抗性筛选浓度进行了研究。结果表明,12 mg·L~(-1)的picloram能较快诱导出体细胞胚及FEC;农杆菌菌液浓度OD600=0.4并侵染30 min为FEC转化效率及植株再生率的最佳条件;共培养后,通过逐渐增加潮霉素筛选浓度(0,5,8,15 mg·L~(-1))能更有效地提高植株的再生率。     

农杆菌介导转化蝴蝶兰遗传体系的研究

为建立蝴蝶兰植株的高效遗传转化体系,以蝴蝶兰花梗腋芽诱导的类原球茎体为受体材料,利用农杆菌侵染并在侵染前后辅以超声波及负压处理的方法将gus基因导入到蝴蝶兰中,经过近90 d的筛选,获得了69个抗卡那霉素抗性PLB,经X-gluc组织化学染色法观察检测,表达率最高达39%,并获得了50株再生蝴蝶兰,其中17株PCR检测呈阳性。初步建立了蝴蝶兰遗传转化体系。另外,我们在农杆菌侵染前后辅以超声波及负压处理,可以提高转化效率。     

农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系优化

生根困难和转化效率较低是农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系的应用瓶颈。本研究以柯字棉312为研究材料,探讨茎尖遗传转化中植物生长调节剂、生根诱导时间、无菌苗型、针刺处理等对茎尖生根率、茎尖形态以及抗性苗产生率等的影响。结果表明,1.5 mg/L NAA能够有效提高生根率,促进茎尖伸长;生根诱导时间是生根率的重要影响因子;经多次针刺处理的正常苗抗性苗率较高;培养5 d的正常苗茎尖生长速度和状态优于黄化苗。     

农杆菌介导的三月茄遗传转化体系的优化研究

以普通三月茄为材料,利用农杆菌介导法对茄子进行遗传转化.通过设置一系列对照组,筛选出最佳诱导分化培养基及高效的抗生素组合、对比茄子子叶与下胚轴的诱导分化效果,从而对茄子的遗传转化体系进行优化和改良.结果表明:最佳诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+ZT 1 mg/L;使用子叶作为外植体时,农杆菌介导的茄子遗传转化率达到了11.02%,其愈伤组织和不定芽的诱导率均显著高于下胚轴;当采用Carb 250 mg/L+Kan 100 mg/L的组合时,可以得到最佳的诱导效果,且在一定范围内,适当降低Carb与Kan浓度的比值,可以提高出愈率.     

农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化

[目的]探讨魔芋愈伤组织培养基、不同转化条件(菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间)及转化植株的筛选条件(抗生素浓度和乙酰丁香酮(AS)浓度)等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记,对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d,用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d,卡那霉素100 mg/L,羧苄青霉素250 mg/L,AS浓度100μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测,结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论]为魔芋抗病品种的转基因培育,丰富其种质资源,寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。     

农杆菌介导的柳枝稷遗传转化体系的优化

【目的】为建立农杆菌介导的柳枝稷高效再生及遗传转化体系。【方法】试验以柳枝稷品种Alamo、Performer及Blackwell的成熟种子为外植体诱导愈伤组织。愈伤诱导6周后,借助解剖镜观察愈伤形态,去除愈伤组织外层含水量大、海绵状愈伤组织,挑选位于愈伤组织中心位置的核状、紧实型愈伤置于继代培养基培养。暗培养3周后,在解剖镜下挑选结构松脆、生长旺盛的愈伤组织按细胞系继代增殖培养。该类愈伤组织易于分化,属单子叶植物愈伤组织分类中的第Ⅱ型。经两次继代增殖培养后,可以获得足够的愈伤组织进行再生和遗传转化研究。为优化柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的农杆菌侵染流程,试验比较了3种农杆菌侵染流程下的转基因效率。真空和干燥处理（VD）：将装有愈伤组织及菌液的50 mL离心管置于真空泵中抽真空10 min（压力-0.8MPa）,28℃, 80 r/min慢摇20 min后弃菌液,将愈伤组织堆放于3层滤纸上干燥处理2 h,随后将愈伤组织转入含有500 μL无菌水的2层滤纸上进行共培养;冷处理加真空和干燥处理（CVD）：侵染前将愈伤组织置于3%麦芽糖、300 μmol·L^-1谷氨酰胺（Gln）溶液中冰浴20 min,然后依VD流程侵染,共培养阶段用MP培养基代替无菌水;渗透冷处理加真空和干燥处理（PVD）：用6%的麦芽糖溶液替代CVD中3%麦芽糖溶液。通过比较Gus染色及PCR阳性率来评价三种方法的转化效率。【结果】愈伤挑选方法不仅从柳枝稷低地型品种中挑选得到再生率达95%以上的Ⅱ型愈伤细胞系,也首次获得高地型品种Blackwell的Ⅱ型愈伤组织,分化率达50%。不同转化方法评价过程中发现,低地型品种AlamoⅡ型愈伤组织采用CVD农杆菌侵染流程转化效率最高,达72%,显著高于侵染流程VD（53%）和PVD（44%）。应用CVD转化法,Performer转化率达96%;首次成功进行了高地型品种Blackwell的遗传转化,转化效率为5.6%。【结论】本研究建立了借助解剖镜挑选柳枝稷易于再生的Ⅱ型愈伤组织的方法,该方法适用于柳枝稷不同生态型品种;农杆菌转化过程中采用CVD侵染流程可显著提高转基因效率。本研究首次报道了柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的挑选流程,建立了适合不同生态型柳枝稷的高效再生及遗传转化体系,首次获得高地型品种Blackwell的转基因植株,为柳枝稷遗传改良及其功能基因研究奠定基础。该方法也适用与其他难于再生的单子叶植物再生及遗传转化体系的建立。     

农杆菌介导花生胚小叶遗传转化体系的优化研究

花生是我国重要的油料作物和经济作物,但较低的遗传转化效率阻碍了花生基因工程的发展。因此,建立高效的花生转化体系是目前的研究热点之一。基于教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室建立的花生胚小叶高效再生体系,本研究对农杆菌介导的遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间及共培养时间对抗性丛生芽效率的影响进行探讨,旨在优化遗传转化条件,提高花生转基因的遗传转化效率。结果表明,3个因素均对抗丛生芽诱导率有显著影响,其诱导效应是共培养时间>侵染时间>菌液OD值。根据研究得到农杆菌介导花生胚小叶转化的最佳条件是菌液OD值0.5、侵染时间25min、共培养时间3d。     

农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

农杆菌介导的白杨遗传优化体系研究

以杂种白杨353为研究材料, 利用农杆菌介导法转化pAB5启动子诱导外源基因删除系统, 采用正交实验设计, 以叶盘分化率为评价指标, 优化转化过程中主要影响因子。结果表明:优化体系为菌液OD₆₀₀值0.8, 侵染时间8 min, 乙酰丁香酮浓度200 μmol/L, 分化培养基中卡那霉素浓度35 mg/L, 头孢霉素浓度350 mg/L, 抗性芽生根时的筛选卡那霉素选择压25 mg/L。采用上述遗传优化体系, 杂种白杨353叶盘分化率达80.00%, 抗性植株经PCR检测, 初步确认pAB5启动子诱导的外源基因删除系统已转入其基因组中, 为检测外源基因删除系统在杨树中的有效性提供了参考依据。     

农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究

通过对农杆菌介导的烟草遗传转化方法进行优化 ,建立了一种快速高效的烟草叶盘遗传转化体系。用OD60 0 为 0 .5的农杆菌悬浮液侵染大小约 1cm× 1cm烟草叶盘 6～ 9min ,然后置于以MS为基本培养基附加 2 .2 5mg/L 6 BA和 0 .3mg/LNAA的分化培养基上 ,在 10 0mg/L卡那霉素选择压下 ,2 12 8d可获得抗性不定芽。通过卡那霉素生根筛选和PCR扩增鉴定 ,其阳性转基因植株频率可达 5 7.1%。     

农杆菌介导的莴笋遗传转化体系初步研究

为了研究农杆菌介导的莴笋遗传转化的影响因素,建立莴笋高效遗传转化体系,通过设置不同预培养、共培养时间,探讨其对外植体芽分化率的影响;设置不同农杆菌菌液浸染浓度及浸染时间,探讨其对外植体致死率的影响。试验结果表明,对莴笋外植体预培养2d,外植体芽分化率最高;共培养0、1、2d,外植体芽分化率差别不大;当农杆菌菌液OD600值为0.3、0.5,分别侵染1、3、5min,外植体致死率相差不大。因此,在莴笋遗传转化中,采用外植体预培养2d、共培养2d,农杆菌菌液OD600值为0.5、侵染时间5min的遗传转化体系能提高莴笋的遗传转化率。     

农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系研究

以铁皮石斛原球茎为受体,研究了农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系,对遗传转化中的草甘膦筛选压力,菌液浓度,乙酰丁香酮浓度,预处理方法,侵染时间,美罗培南浓度等转化影响因子进行了优化。结果表明,摁压处理下的原球茎在添加浓度为200μmol·L-1乙酰丁香酮的菌液中侵染30 min,菌液浓度OD600为1.0,共培养48 h后,转入添加质量浓度为50 mg·L-1美罗培南和质量浓度为2.0 mg·L-1的草甘膦筛选培养基中,转化效率最高。经GUS组织化学染色及PCR分析鉴定,初步证明ACC合成酶反义基因已整合到铁皮石斛的基因组中。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

根癌农杆菌介导观赏羽衣甘蓝遗传转化体系优化

为建立稳定的羽衣甘蓝遗传转化体系,以羽衣甘蓝自交系'Mark 10','W02-7'和'Curly 6'为试材,通过单因子试验,比较羽衣甘蓝子叶、子叶柄、子叶片、下胚轴4种外植体的再生能力,筛选培养基中的适宜激素浓度,优化了羽衣甘蓝不同外植体的再生体系。将播种后6d的子叶于最适再生培养基上进行黑暗预培养,以根瘤农杆菌为介导侵染子叶后,于黑暗条件下进行农杆菌与植物材料的共培养。随后转入含有头孢霉素的抑菌培养基中进行抑菌培养,再将子叶移入含有卡那霉素浓度的筛选培养基中进行抗性芽选择,并提取植物基因组DNA进行目的基因的PCR验证,从而建立高效的羽衣甘蓝遗传转化体系。结果表明:最佳的外植体是羽衣甘蓝的子叶,在培养基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1上,不定芽分化率可达100%;子叶经2～3d预培养,将OD600值为0.3～0.5的携带DFR基因表达载体的农杆菌菌液离心,以50mL MS重悬液重悬,侵染外植体5min,共培养2d;采用头孢霉素300mg·L-1,抑菌培养3d后,采用10mg·L-1卡那霉素进行抗性芽选择。在播种后30～40d共获得了24个抗性芽,以抗性芽的基因组DNA为模板进行PCR扩增,9株呈DFR阳性,显示外源基因已经成功整合到羽衣甘蓝基因组中,平均转化率为37.5%。本研究结果可以为羽衣甘蓝重要性状基因的遗传转化提供依据。     

农杆菌介导苎麻叶片遗传转化体系的研究

研究建立了苎麻叶片外植体再生体系,确定了对苎麻转化体和非转化体进行筛选的Kan浓度为25mg/L。通过比较不同的条件对通过农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的影响,建立了农杆菌介导苎麻叶片遗传转化的体系。     

农杆菌介导大豆遗传转化优化的初步研究

利用农杆菌对大豆成熟种子子叶节进行转化,探究了不同种植物提取物、植物提取物浓度、大豆基因型、萌发天数以及共培养天数对提高农杆菌遗传转化效率的影响。结果表明:含有植物提取物的共培养菌液侵染子叶节均能够明显提高抗性芽的再生率,但不同基因型的大豆所需的最适提取物浓度不同,‘豫豆22’最适浓度为7mL/L,‘中黄42’最适浓度为14mL/L;‘豫豆22’是本研究中最适宜转化的大豆基因型;萌发5d的大豆子叶节转化率最高;共培养10d获得阳性转化植株率最高。     

农杆菌介导仙客来遗传转化体系的建立

利用根癌农杆菌介导法对仙客来叶片进行遗传转化,研究影响仙客来转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.8的工程菌液浓度,侵染时间15 min,4 d的共培养,延迟筛选10 d有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,APX基因已整合到仙客来基因组中,共获得4株转基因植株,转化率为9.3%.