甘菊遗传转化再生体系的建立

[目的] 建立高效稳定的甘菊再生体系,并确定卡那霉素和草丁膦的筛选压。[方法] 以甘菊无菌苗叶片为外植体,通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系。[结果] 在5种芽诱导培养基中,MS3（MS＋NAA 0.1mg/L＋6-BA0.1mg/L）的再生频率最高,可达98%,其不定芽生根率可达100%。培养35d后,添加5和10mg/L卡那霉素的培养基上甘菊再生率为11.3%和10%,添加15和20mg/L卡那霉素的培养基上没有芽的分化;添加0.5mg/L草丁膦的培养基上甘菊再生率为8.7%,添加1mg/L草丁膦的培养基上没有芽的再生,添加1.5和2.0mg/L草丁膦的培养基上没有芽的分化。卡那霉素和草丁膦在甘菊遗传转化中的筛选浓度分别为8.0和0.8 mg/L。[结论] 该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。     

农杆菌介导的燕麦创伤胚转化体系研究

通过建立遗传转化体系,培育具有特定功能的转基因作物品种对改善作物的生存能力和生态环境适应力具有重要意义。参照农杆菌划胚介导植物萌发种子基因转化方法,以农杆菌菌株LBA4404(含质粒p CAMBAR.CH I.11)侵染转化燕麦种子,对转化体系中的菌液浓度、超声波功率、种子处理方式和抗除草剂筛选等不同转化条件分别进行了研究,以探索农杆菌介导的燕麦最适宜的遗传转化体系。结果表明:燕麦种子浸泡4 h后采用穿刺法划伤种子,1 000 W超声波处理划伤种子10 min,在OD600=0.4的农杆菌溶液中共培养2 d,最有利于种子转化;用0.8 mg/L草丁膦溶液与种子共培养能够有效抑制种子萌发进行初筛,用1 mg/L草丁膦溶液喷施幼苗进行除草剂抗性筛选,能够明显抑制假阳性苗的生长;将来自链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的Bar基因导入燕麦,经除草剂筛选以及Bar基因的PCR检测和Southern杂交分析证明获得转基因植株。     

野生白芨再生体系的建立及抗性筛选

建立白芨的再生体系和优化抗性筛选的最佳条件,为野生白芨高效遗传转化体系的建立奠定基础。以野生白芨种子为外植体,研究野生白芨种子在萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化和增殖以及不定根诱导的最佳培养基,并利用梯度筛选出其对卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)的抗性。种子萌发最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L马铃薯;不定芽分化最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸银+50 g/L马铃薯,诱导率高达95%;诱导生根最佳培养基为1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L马铃薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp为野生白芨遗传转化的最佳筛选压;培养过程中添加外源有机物可以有效地促进愈伤组织和不定芽的分化与增殖。建立了野生白芨种子的再生体系,发现了野生白芨种子的第3条发育途径——愈伤组织分化途径,并筛选出了适宜于野生白芨遗传转化体系的Kan和Amp筛选压。     

大白菜高效稳定遗传转化体系的建立

以无菌苗下胚轴为外植体,建立了大白菜高效、稳定再生和遗传转化体系,获得了转基因抗性芽。结果表明,转化效率最高的基因型为Seoul,最佳筛选培养基为MS＋2mg／L6-BA＋1mg／LNAA＋2mg／LAgN03＋300mg／L Car＋10mg／LHyg,共培养基pH5．2,完全黑暗培养,侵染液浓度OD600=0．5,侵染时间为10min,在此条件下转化效果最好。GUS染色结果表明,GUS基因已整合到抗性芽细胞的染色体中,能够稳定表达。     

草铵膦对油菜种子萌发和根尖细胞遗传毒性的影响

[目的]探讨草铵膦对油菜种子萌发和根尖细胞遗传毒性的影响。[方法]模拟不同浓度和处理时间下,低剂量草铵膦残留对甘蓝型油菜萌发后幼苗生长初期的生长发育和根尖细胞分裂活动的影响。[结果]草铵膦处理对油菜发芽期幼苗下胚轴、初生根等性状的抑制效果随处理浓度的升高和处理时间的延长而增强;0.000 01%的草铵膦残留即可对油菜地上部分和地下部分产生明显的抑制效果,下胚轴对草铵膦的敏感性显著大于初生根;0.005%的草甘膦处理根尖4 h可显著抑制油菜根尖分生区细胞的有丝分裂,其抑制作用随浓度的升高和处理时间的延长逐步增强,并可诱发细胞产生染色体桥、染色体落后、多级分裂、间期微核、染色体浓缩等染色体变异。[结论]试验结果为草铵膦在油菜田使用的安全性评估提供了理论依据。     

农杆菌介导的胡麻转化因子的优化

农杆菌介导法是植物遗传转化的重要方法之一,为了提高农杆菌介导的胡麻遗传转化效率,以‘陇亚10号’和‘定亚22号’下胚轴为基因转化受体,以pCAMBIA3301为转化质粒,分析草铵膦选择压、下胚轴预处理(剥表皮、预培养)、农杆菌菌株、侵染时间和乙酰丁香酮对gus表达率/频率和抗性苗率的影响,优化以上转化因子参数,建立高效的胡麻遗传转化体系,为后续的胡麻功能基因组学研究和遗传改良奠定基础。结果表明:下胚轴愈伤组织诱导、分化和再生苗生根阶段的草铵膦选择压分别是10mg/L、5mg/L和2mg/L;下胚轴预处理对gus表达率/频率无显著影响,却显著影响抗性苗分化率,不剥表皮和预培养3d抗性苗率分别提高5倍和9倍;农杆菌菌株和侵染时间都显著影响gus表达率/频率和抗性苗率,C58c1侵染60min时gus表达频率最高,为7.5,抗性苗率为60.3%。乙酰丁香酮能显著提高C58c1和GV3101介导转化时gus表达频率。     

花生上胚轴为外植体的植株再生及转化研究

以8 d龄花生无菌苗的上胚轴为外植体,进行植株再生和农杆菌介导遗传转化研究.结果表明,上胚轴能高效诱导花生植株再生,外植体在MS 3 mg/L TDZ 6 mg/L 6-BA 1.5 mg/L NAA培养基上能高效诱导不定芽分化,10 d时诱芽率达100%;不定芽接种到MS盐 B5维生素 3mg/L TDZ 0.01%酵母粉培养基中15 d诱导出大量丛生芽;MS 0.5 mg/L NAA培养基较适合诱导丛生芽生根,25 d时生根率达82%.筛选确定35 mg/L潮霉素浓度为转化筛选压,以含AtRD29Ap::GUS融合基因的根癌农杆菌侵染8 d龄上胚轴10 min,共培养3 d,经上述再生体系,以潮霉素筛选获得1株拟转化再生植株.     

抗除草剂转基因水稻和大豆快速准确检测技术研究

以实验室培育的转基因水稻和大豆为研究材料,对含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene,bar)和不与草甘膦结合的突变型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶编码基因(5-enolpyruvylshi-kimate-3-phosate synthase gene,EPSPS)2种不同除草剂筛选标记的转基因植株进行叶片喷涂、叶片离体平板培养、种子萌发试验,以建立快速、准确的转基因鉴定方法,并探索可有效区分转化和非转化植株鉴定用的筛选剂剂量.结果表明:这3种方法都能快速、简便、准确地鉴定相应的转基因植株;水稻和大豆叶片对农药吸收具有一定的差异,用300或135 mg/L草铵膦可有效区分是否转入bar基因,用1％或0.25％农达喷施可区分是否转入EPSPS基因;用含有50 mg/L草甘膦的平板培养离体大豆叶片可以方便地区分出转基因株系;种子萌发对除草剂剂量十分敏感,用远低于10 mg/L的2种除草剂即可有效区分阳性与阴性种子.本研究建立的快速鉴定转基因植株的方法在转基因研究材料的鉴定及转基因安全评估中具有重要意义.     

花椰菜高效再生体系建立及农杆菌介导的遗传转化研究

以栽培品种"银峰80天"的下胚轴与子叶为外植体,建立花椰菜高效组织再生体系,并研究卡那霉素浓度、侵染时间和共培养时间等因素对花椰菜愈伤组织分化的影响。结果表明:以MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA0.1mg/L作为分化培养基时,下胚轴的分化频率达88.9%,子叶的分化频率达97.6%;农杆菌介导花椰菜遗传转化时,OD600=0.4,下胚轴和子叶的侵染时间为1 min,下胚轴和子叶分别共培养1 d和3 d后进行筛选,有利于花椰菜再生芽的分化获得抗性苗。     

农杆菌介导的橡胶草遗传转化体系的建立

以橡胶草为试验材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化研究。结果表明:50mg/L的卡那霉素(Kan)对橡胶草的抗性芽具有很好地筛选效果,生根筛选时,Kan的适宜质量浓度为35mg/L;最佳抑菌抗生素为羧苄青霉素(cb),适宜质量浓度为500mg/L,获得35株抗性试管苗,通过GUS染色及分子生物学检测,最终获得6株转基因植株,转化率为17.1%。可见,获得的橡胶草转基因植株,为橡胶草后续的遗传转化研究奠定了基础。     

NAA对黄豆芽生长的影响

[目的]研究不同浓度NAA对黄豆芽萌发和生长的影响。[方法]以中黄35为供试材料,采用不同的NAA浓度（0．01、0．10、1．00、10．00mg／L）对黄豆种子进行萌发培养试验,培养7d后分别测量黄豆种子的萌发率以及胚轴、胚根和胚芽的长度,比较不同浓度的NAA对黄豆种子萌发时的胚轴长、胚轴胚根比的影响。[结果]当NAA的浓度小于10．00mg／L时,增加NAA浓度能促进黄豆萌发,NAA浓度为1．00mg／L时黄豆种子萌发率高达58．9％;浓度分别为0．01、1．00、0．10和10．00mg／L的NAA均能提高黄豆种子的轴根比,10．00mg／LNAA溶液处理黄豆种子的轴根比最大,平均为2．15,商品性状最好。[结论]10．00mg／L的NAA溶液处理黄豆可以获得最佳的轴根比和商品性状,对农业生产具有指导意义。     

卡那霉素和潮霉素对不同类型油菜种子萌发的影响研究(英文)

[目的]研究卡那霉素(Kan)和潮霉素(Hyg)对甘蓝型油菜、芥菜型油菜和白菜型油菜种子萌发和幼苗生长的影响。[方法]将甘蓝型油菜春K101、芥菜型油菜L0935和白菜型油菜L0926种子分别播种在含有不同浓度Kan或Hyg的1/2MS培养基上,比较不同条件下油菜下胚轴和主根生长的变化。[结果]50mg/L的Kan对油菜的下胚轴生长有促进作用,但对主根的生长有较明显的抑制。Kan对芥菜型油菜种子萌发和幼苗生长的影响最大。Hyg对不同类型油菜的下胚轴和主根生长都有明显的抑制作用。[结论]Kan可用于芥菜型油菜遗传转化实验中转化体的筛选,Hyg对转基因油菜种子筛选的最佳浓度为40~60mg/L。     

农杆菌介导创伤胚转化的应用

[目的]优化农杆菌介导创伤胚转化的方法,提高转化率,培育具有特定功能的转基因品种,改善作物的生存能力和生态环境适应力。[方法]参照农杆菌划胚介导植物萌发种子基因转化方法,以燕麦、玉米和高粱的萌发种子为试验材料,农杆菌菌株LBA4404(含质粒P3301ubi Ac)侵染转化燕麦、玉米和高粱的萌发种子,优化转化条件,探索燕麦、玉米和高粱遗传转化体系,探讨菌液浓度、种子萌发时间、超声波功率、乙酰丁香酮和草丁膦浓度对3种作物的影响并进行比较分析。[结果]农杆菌菌液浓度为0.6OD600≥0.4时转化效果最佳;第1次超声波功率为900 W,处理时间为10 min;第2次超声波功率为200 W,处理时间为4 min效果最佳。转化效率最高;添加乙酰丁香酮对燕麦、高粱和玉米的发芽有明显促进作用,但转化效果有明显区别;燕麦、玉米和高粱的转化植株对草丁膦的耐受性差异不大,与非转化植株相比,0.8 mg/L除草剂胁迫下燕麦、玉米和高粱种子萌发受到一定程度的抑制。用1 mg/L除草剂溶液对T0和T1代转化植株幼苗进行筛选,转化植株的存活率高于对照。[结论]经除草剂筛选和PCR对T0和T1代幼苗检测,初步证明获得了转化植株。     

金鱼草基因转化中卡那霉素筛选压力的确定

在以抗生素为筛选标记的基因转化中,确定适宜的筛选压力是提高基因转化率的前提。本研究以卡那霉素为筛选标记,在10、20、30、50和100mg／L的筛选压力下,根据金鱼草下胚轴外植体的生长表现、愈伤组织和芽的分化率确定适宜的筛选浓度。结果表明,适宜卡那霉素的筛选浓度为50mg／L。以此浓度为筛选压力进行遗传转化所获得的部分再生苗经Southernblot鉴定,均为转化株。     

根癌农杆菌介导转录因子CBF1基因对菊花的转化

利用根癌农杆菌介导法对菊花品种'小金黄'叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.5的农杆菌菌液添加50 mg/L AS,侵染时间3 min,2 d的共培养,从分化培养基获得的抗性芽在生根培养基MS+0.4 mg/L NAA+10 mg/L Km+100 mg/L Cef上进行延迟筛选,有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,CBF1基因已整合到菊花基因组中,共获得18株转基因植株,在抗性株系中PCR阳性率为36.7%.     

提高草木犀遗传转化植株再生率技术的研究

[目的]确定草木犀遗传转化植株的适宜的除草荆选择压力。[方法]分别以草木犀试管苗的子叶、下胚轴和破坏生长点的茎尖为外植体,在含有0、1、3、5、10mg／L除草剂草丁膦的分化培养基Ms＋BA3mg/L＋LAA0．2mg/L中对其进行分化培养,筛选适宜的除草剂选择压力,在此选择压力下,对外植体进行遗传转化,并对转化芽进行分子水平检测。[结果]当除草剂浓度为3mg/L时,所有外植体均无再生芽;转化培养后,子叶、下胚轴和破环生长点的茎尖的再生率分别为0．48％、4．29％和10．1t％;分子水平检测结果显示,外源基因已成功转入草木犀转化芽中。[结论]除草剂对草木犀外植体的适宜选择压力为3mg／L,破坏生长点的草木犀茎尖对外源基因的转化效率较高。     

平阳霉素处理对花椰菜种子萌发和离体茎尖存活的影响

以杂交一代品种雪山椰菜花和自交系SZ-70为供试材料,研究了不同平阳霉素处理浓度对种子萌发的影响、不同激素种类和浓度对不定芽诱导和增殖培养的效果以及不同平阳霉素处理浓度对离体培养茎尖存活的影响。结果表明：以6-BA2mg／L和NAA0．25mg／L诱导茎尖产生不定芽的效果优于子叶和下胚轴;6-BA0．2mg／L＋NAA0．02mg／L＋MET0．2mg／L对不定芽的增殖效果最佳;平阳霉素处理对种子的萌发率影响不明显,处理浓度越高,种子萌发后真叶抽出率越低;随着平阳霉素处理浓度的提高,茎尖存活率下降,且异常苗和玻璃苗增加,平阳霉素80mg／L、30min的处理对茎尖的诱变效果较为适合。     

番木瓜组织培养技术及植株再生的研究

利用番木瓜无菌种苗顶芽几下胚轴茎段为外植体,研究不同激素配比对芽诱导和生根的影响,获得番木瓜组织快繁技术。结果表明:赤霉素能提高番木瓜种子的发芽率,最适合番木瓜种子萌发的培养基为MS1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L GA3;顶芽及茎段的芽诱导为MS+0.25mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA;最适合番木瓜增殖为MS+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA;最适合番木瓜生根培养为MS+1.0mg/L 6-IBA+0.5mg/L NAA+1.0g/L AC。本研究为实现今后番木瓜工厂化生产奠定了一定基础。     

3种陆地棉下胚轴对草甘膦抗性筛选的鉴定

为了建立以草甘膦为选择标记且具有高效筛选效率的棉花遗传转化体系,研究选取WC,R15和新陆早45号这3个具有成功再生体系陆地棉的下胚轴为试验材料,分别以选择压2.5,5,10,20,50,100 mg/L的草甘膦质量浓度梯度进行草甘膦敏感性试验。结果表明,WC,R15和新陆早45号的最适抗草甘膦质量浓度分别是5,20,10 mg/L。说明不同陆地棉品种下胚轴具有不同的草甘膦抗性,选择合适浓度的草甘膦是获取阳性转化体的关键之一,研究为提高以草甘膦为选择标记的棉花转基因试验的筛选效率提供了技术支持。     

冬珊瑚胚轴离体培养及植株再生

用MS培养基对冬珊瑚种子进行无菌萌发,在附加不同种类、不同浓度激素的MS培养基上,对冬珊瑚胚轴进行愈伤组织及不定芽的诱导分化,生根培养,并对试管苗进行移栽试验。结果表明,在培养基MS NAA0.5mg/L BA2.0mg/L中胚轴愈伤组织诱导较快,且易形成芽,但是不定芽数量少;在1/2MS NAA0.6mg/L培养基上生根率达100%;移栽成活达85%。