鸡腺胃型传染性支气管炎病毒山东分离株S基因的克隆及序列分析

为研究3株鸡腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)山东分离株(青岛腺胃株QX株、东营腺胃株DY株、肥城腺胃株FC株)病毒纤突蛋白基因(S基因)的核苷酸特征,与呼吸型M41标准株及肾型IBV进行S基因核苷酸进行同源性比较。采用RT-PCR技术方法,对IBV分离株(QX、DY、FC)及标准毒株M41株S基因进行克隆和序列测定,对其中QX和DY株S基因核苷酸分别用3种方法(Clustal V method、Jotun Hein method和Clustal W method)对获得的基因核苷酸序列进行分析。结果显示,QX株和DY株的S基因核苷酸与标准毒株M41株S基因核苷酸的同源性最高为79.3%和79.2%,最小差异性为24.5%和22.3%。QX株和DY株与肾型IB分离株HD同源性最高为78.4%和78.9%,最小差异性均为22.7%。HD株与M41株的同源性最高达到80.8%。通过对S基因进化关系分析,说明腺胃型IBV山东分离株(QX、DY株)与呼吸型和肾型IBV是引起不同组织嗜性的IBV变异株,与呼吸型IBV和肾型IBV有明显的差异,是在IBV遗传变异进化过程中具有重要地位的进化阶段。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)SC株S1基因，连接到pMD 18-T载体上，克隆后进行了核酸序列分析，证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H120和M41的同源性较低，分别为81．1％和80．0％，而与国内JX9901株的同源性达到91．3％，初步证实国内存在IBV新毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒KIBVXJ株S1基因的克隆及序列分析

根据已发表的鸡传染性支气管炎病毒S1基因,设计并合成了一对引物,经RT-PCR扩增后获得全长约为1700bp的核苷酸序列。序列分析表明,S1基因的最大开放阅读框位于12位～1685位碱基之间,编码557个氨基酸;KIBVXJ株S1基因序列在19位～292位点的氨基酸区域内有较多的氨基酸置换、插入和与缺失现象;S1的裂解位点的序列为HRRRR,具有我国地方流行株的特征。KIBVXJ株的S1基因与国内外疫苗株的同源性分析表明,核苷酸同源率为73.8%～74.2%,氨基酸同源率为74.9%～76.0%。遗传进化分析表明,KIBVXJ株与国内外的主要疫苗株亲缘关系最远,与国内近年来分离的A2株、LX4株和QXIBV株的亲缘关系最近。     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株核蛋白基因的克隆与序列分析

本研究参考已发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，设计了一对核蛋白基因的特异性引物NP5、6，经RT-PCR扩增得到了IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的1199bp的核蛋白基因片段，并进行了克隆和序列测定。将4个国内分离株核蛋白基因的序列与国外发表的参考毒株的核蛋白基因序列进行了比较和分析，结果显示这4个毒株与澳大利亚群的参考毒株亲缘关系最为密切，核苷酸序列同源性86%-91%。其中DC株发生了较大程度的变异。国内分离株核蛋白基因核苷酸的变异引起了蛋白质二级结构的部分改变。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N基因的克隆与序列分析

参照Gen Bank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核酸序列设计了1对引物,利用RT-PCR扩增了1个广西分离株的N基因cDNA片段,并将其克隆到p MDl8-T载体中。序列分析结果表明,N基因序列全长为1 230 bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;分离株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%;分离株与LX4株、BJ株关系较近,与疫苗株处于不同的进化分支,亲缘关系较远,是新的IBV变异株。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株M基因的克隆与序列分析

参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的核苷酸序列设计1对引物,利用 PCR 扩增IBV广西株的M基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中.序列分析结果表明,M基因全长为678 bp,编码225个氨基酸,近N端含有2个潜在的N-糖基化位点,3个跨膜区位于23—98肽段区,亲水区较疏水区更易变异.IBV广西株与国内外IBV参考毒株相比,核苷酸序列同源性为83.6%~92.5%,氨基酸序列同源性为82.7%~95.1%.系统进化分析结果显示IBV广西株与SAIB20和LX4两参考株位于同一个分支上,它们的亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远.结果表明IBV广西株是1株新的IBV变异株.     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT－PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的1636bp的S1全基因DNA片段；以Sanger‘s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列，推导出了氨基酸序列，并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明，IBV－D971毒株与国内外AF140352（山东农业大学）、AF154841(山东农业大学）、AF193432（青岛动物检疫所）、AY043312（中国农业大学）、AF397528（四川农业大学）、AY043221（浙江农业大学）、AF352312（浙江农业大学）、U29522（澳大利亚）和M21883（英国）毒株的核苷酸同源性分别为99％、99％、95％、94％、87％、86％、88％、82％和80％。氨基酸序列同源性依次分别为93％、93％、87％、83％、83％、82％和80％。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株S1基因的克隆与序列测定

根据基因库中收录的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因的序列 ,设计了一对引物并采用RT -PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒HN99株的S1基因 ,扩增产物进行了克隆、测序 ,获得了IBVHN99株S1基因片段 ,其大小为1 739bp(含前导序列 ) ,其核苷酸序列与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte的S1基因核苷酸序列同源性较低 ,分别为 79.1 %,79.2 %,77.3%,77.8%,79 .4%,有大量的点突变并伴有基因插入和缺失 ;IBVHN99株的S1基因推导的氨基酸与H1 2 0、H52、M41、Gray、Holte株氨基酸的同源性分别为80 .1 %,79.9%,79.5%,78.5%,78.5%,经S1基因系统进化分析 ,提示IBVHN99株与其它各毒株的亲缘关系较远 ,初步证实IBVHN99株为一新的IBV毒株     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒金坛分离株核蛋白基因的克隆和测序

应用逆转录多聚酶链反应技术，参照Boursnell等发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，自行设计并合成1对引物，应用该引物，从感染IBV金坛株的第五代SPF鸡胚尿囊液中扩增出片段大小为828bp的JT N基因，与设计相符，表明扩增片段为IBVJT株N基因。将扩增片段与pGEM-T Easy载体连接，经核酸序列测定，与Genebank中报道的IBV其它株N基因同源性较高。     

鸡传染性支气管炎病毒SX-H09株膜蛋白基因的克隆及序列分析

对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)陕西分离株SX-H09株膜蛋白(M)基因进行克隆和序列分析.根据GenBank发表的IBV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增IBV M基因片段,并进行克隆、序列测定和分析.结果表明,SX-H09株M基因全长为678 bp,编码225个氨基酸.同源性比较可知,SX-H09株M基因...     

鸡肾型传染性支气管炎病毒QD株S1基因的克隆与序列分析

One nephropathogenic infectious bronchitis virus （IBV） strain was isolated from Qingdao city, named as QD isolate.S1 gene of the strain was amplified, cloned and sequenced. The S1 gene of QD isolate was composed of 1620 nucleotides, and a spike glycoprotein cleavage recognition site was Arg-Arg-Phe-Arg-Arg. The nucleotide acid similarities among the nine IBV vaccine strains and the QD strain were 78.8% to 82.2%. Phylogenetic analysis based on the S1 genes showed that QD strain and the vaccine strains belonged to different clusters, and showed larger evolutionary distances, but showed the smaller evolutionary distances with the field nephropathogenic IBV strains in China. The result showed that nephropathogenic IBV strains were widely popular in China, and the QD strain could be used as the infectious bronchitis vaccine candidate strain.     

传染性支气管炎病毒嗜腺胃毒株(ZJ971毒株)结构蛋白和S1基因的结构分析

对来自浙江地区的传染性支气管炎病毒嗜腺胃毒株（ＺＪ９７１株）的结构蛋白进行了ＳＤＳ电泳分析，用ＲＴ－ＰＣＲ扩增其Ｓ１基因ｃＤＮＡ，并作了测序分析。结果显示，ＺＪ９７１株结构蛋白由２１２０００、１４６０００、９７４００等８条蛋白带组 其他传染性支气管炎病毒株相比缺损１１６０００蛋白条带；Ｓ１基因全长为１７２０ｎｔ，编码１条５５１个氨基酸组成的多肽，其核心苷酸与其他传染性支气管炎病毒株的同源性为９９．     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株（SY株）的免疫原S1基因cDNA，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点中，测定插入片段核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。序列分析表明，SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、N1-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80%。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株S1基因的克隆及其鉴定

用自行设计的 1对引物 you1 和 you2 -对 5个传染性支气管炎病毒 (IBV)地方分离株 (HN2 ,HN4,JX1,SC2和SC4)的基因组 RNA进行 RT- PCR,均成功地扩增出预期大小 (约 16 30 bp)的目的片段 ,经 PCR、酶切鉴定为 S1基因。将 5个毒株的 S1基因克隆到 p GEM- T载体中 ,重组质粒经 Eco R 和 Hind 单酶切以及用引物 you1 和 you2 -进行质粒 PCR扩增鉴定 ,证明 IBV- S1基因已成功地克隆到了 p GEM- T载体中。同时 ,为了测序的方便 ,还将 IBV- S1基因作了目的片段 (约 10 6 0 bp)的亚克隆并进行了鉴定     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆

利用 ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经 ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 ＳＹ毒株 Ｓ１基因,得到预期的１．７ｋｂ片段。并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒载体ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ酶切位点,在大肠杆菌ＤＨ_(5a)中实现目的基因的克隆,获得ＳＹ毒株Ｓ１基因重组质粒。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因免疫对鸡的保护作用

将鸡传染性支气管炎病毒肾型 Ｔ 株 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 连接于ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 的 Ｈｉｎｄ Ｉ Ｉ Ｉ与 Ｂａ ｍ Ｈ Ｉ位点之间构建含有 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子及 Ｂ Ｇ Ｈｐｏｌｙ Ａ 信号序列的鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 蛋白真核表达质粒。实验证明, Ｓ Ｐ Ｆ 鸡肌注免疫后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体逐渐升高,至第３５ 日龄左右达到高峰,攻毒后血清 Ｉｇ Ｇ 抗体先下降而后升高,血清 Ｉｇ Ｇ 抗体升高幅度不及 Ｉ Ｂ 油苗免疫组。质粒 Ｄ Ｎ Ａ 免疫鸡攻毒后有４０ ％ 的鸡可耐过强毒的攻击,说明 Ｓ１ 基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力。     

鸡肾型IBV的分离及其N基因的克隆与测序

通过病毒形态学观察、血凝试验、病毒干扰实验、动物回归实验等分离鉴定了1株鸡肾型传染性支气管炎病毒.利用RT-PCR技术对分离毒株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析,证实分离株为肾型IBV.     

Cloning and Sequence Analysis of M Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus Guangxi Strain

According to the M gene nucleotide sequence of avian infectious bronchitis virus (IBV) published in GenBank,one pair of primers were designed,the M gene fragments of IBV isolated from Guangxi province were amplified by PCR.Then the amplified fragments were cloned into pMD18-T vector and the positive recombinant plasmids were sequenced.The results showed that M gene from all of the IBV isolates consisted of 678 bp,coding for 225 amino acids.Two glycosylated sites were located nearby the N-terminal,three transmembrane domains were located in the 23 to 98 peptide region.Variations within the hydrophilicity region were easier than that in the hydrophobicity region.Compared with that of other published IBV strains,the homologies of nucleotide and amino acid sequences of the isolates were 83.6% to 92.5% and 82.7% to 95.1%,respectively.The phylogenetic tree analysis showed that it was closely related to SAIB20 and LX4,and clustered into one group;But it belonged to different branches with other reference strains,and had a distant relationship.These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料.