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依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞能完全适应且生长状态良好;当血清浓度降至10mL/L时,传代1次细胞无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96h各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用该低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种PCV-2后,通过荧光抗体染色测定病毒滴度。结果显示,低血清培养的PCV-2病毒滴度为10~(6.5)TCID_(50)/mL,与常规条件培养的PCV-2对照(病毒滴度为10~(6.375 )TCID_(50)/mL)差别不明显,表明该体系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15细胞低血清培养PCV-2体系,为PCV-2的相关研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗的工艺,提高PCV2疫苗生产效率,降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化,并在无血清悬浮培养体系下,采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数(MOI)(0.10、0.05、0.01和0.001)和不同PK-15细胞接种密度(CDI)(1.0×106、3.0×106、5.0×106/mL)对PCV2增殖的影响,同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养,且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d-1增加到0.6 d-1;悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代,连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d-1附近波动,且细胞活率始终>90%;以1.0×106/mL接种,第4天可达到峰值活细胞密度6.2×106/mL,并可维持1 d,第4天前活率均>90%,此后快速下降;病毒增殖最佳工艺参数为:感染复数为0.05,细胞接种密度为1.0×106/mL,最终收获时病毒滴度可达106.2TCID50/mL;对细胞感染前后的代谢分析发现,病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前,且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累,之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株,PK-15细胞可用于PCV2增殖,结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(4)
研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。 相似文献
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旨在筛选猪圆环病毒2型感染猪肾上皮细胞(PK-15)后差异表达miRNA和mRNA,并探究miRNA和mRNA之间的互作关系。使用茎环定量PCR检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组之间的差异表达水平以发现差异表达miRNA,分析PCV2感染后第12小时的蛋白质组学研究结果(GEO登录号:GSE71945)以获得差异表达mRNA,并分析差异表达miRNA和mRNA之间的互相作用关系。结果显示,在PCV2感染后第12小时miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p等表达量显著性变化,使用miRecords预测其靶基因,分别发现7 105、9 741、7 451、7 183、7 971、8 793个靶基因;PCV2感染后第12小时共有158个差异表达mRNA,分属于多种细胞结构成分并参与多条重要的细胞生物途径,且差异miRNA的靶基因和差异mRNA之间有大量的交集基因。上述结果表明,PCV2感染能导致细胞内多种miRNA差异表达,造成miRNA的靶基因表达紊乱,进而影响细胞正常的生命进程。 相似文献
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利用光学显微镜观察、间接免疫荧光(IFA)、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)等测定方法,分别从病毒抗原分布、病毒基因组复制水平以及病毒感染滴度变化等方面对猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV-67N)在猪肾上皮传代细胞系(PK-15细胞)上的增殖特性进行了研究。使用HEV-67N株感染24孔细胞培养板内的PK-15细胞,接种剂量为400个TCID50(104.37)/孔,间接免疫荧光检测结果显示,在感染后8h即可检测到被荧光抗体标记的感染细胞,且随着感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,至感染后32h,几乎所有的细胞均出现有荧光。Real-time PCR检测结果显示,病毒基因组RNA的复制在感染后32~48h呈快速上升趋势,其基因组拷贝数在感染后48h达到最高值,之后增殖速度减慢,至感染后56h细胞出现CPE。TCID50的测定结果显示,HEV感染滴度的变化趋势与基因组RNA含量的变化相一致,在感染后32~48h增殖速度最快,之后逐渐减缓,至72h病毒感染滴度达到最高。 相似文献
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微载体培养PK-15细胞试验条件的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
为了优化PK-15细胞在微载体上的生长条件,在微载体浓度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液条件下,观察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的细胞接种密度对细胞生长的影响;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培养液、接种密度5×104cells/mg条件下,观察3、5、10 mg/mL微载体浓度对细胞生长的影响;在3 mg/mL微载体浓度条件下、接种密度25×104cells/mL,观察MEM、高糖DMEM和低糖DMEM培养基对细胞生长的影响。结果表明,以微载体接种细胞密度4.5×104cells/mg、微载体浓度5 mg/mL在低糖DMEM培养基中培养方式效果最为理想。优化的培养工艺适用于PK-15细胞的生产。 相似文献
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载体介导的shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖特性的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
利用生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3、pGene-NS3-Negative。重组干扰载体经纯化后转染PK-15细胞,并进行G418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,与对照细胞比较,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子均在一定程度上沉默了病毒的基因,抑制率约为63%、46%、49%。ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。 相似文献
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猪细小病毒在PK细胞中的增殖过程 总被引:4,自引:0,他引:4
将猪细小病毒南京毒株1(NJ-1)、南京毒株2(NJ-2)和7909毒株接种于PK-15细胞,用免疫荧光检测方法研究了猪细小病毒增殖的基本特性与规律。在PK-15细胞中,3个毒株的增殖规律基本相似,均在感染后12h即可检测到荧光,表明其子代病毒粒子产生,随后逐渐增多,在感染后48h荧光几乎遍布所有细胞,随后荧光开始衰减,在84h时病毒引起细胞大面积崩解,荧光呈现岛屿状分布。通过绘制其一步法生长曲线可知,在病毒感染后12h,细胞培养液中的病毒TCID50/ml。为2.0左右,随后逐渐增高,感染后60h3种毒株的TCID50/mL均达到最高,子代病毒粒子向细胞外释放也达到高峰,其后TCID50逐渐下降。培养液中病毒粒子的丰寿期为7h。 相似文献
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利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达10^7.0TCID50/mL.这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。 相似文献
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为了给猪圆环病毒2型的诊断和基因工程疫苗的研究奠定基础,试验根据GenBank中猪圆环病毒2型的核酸序列设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料组织中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pT-ORF2.结果表明:以重组质粒pT-ORF2为模板设计出1对引物,扩增出含ORF2主要抗原位点的区段566 bp,经Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pcDNA3.0,成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-ORF2. 相似文献
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检测猪圆环病毒方法的研究进展 总被引:2,自引:0,他引:2
自1974年,德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中发现了圆环病毒(PCV)以来,圆环病毒迅速席卷全球,给养殖业造成巨大损失。经研究发现,圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属,为已知的最小的动物病毒之一。PCV有两种型,即PCV1和PCV2。PCV1从长期持续污染的猪肾PK-15细胞中分离得到, 相似文献
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为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 相似文献