鸡传染性支气管炎活疫苗耐热保护剂的研究

应用冻干制品加速热稳定性试验,测试三组冻干保护剂配方对鸡传染性支气管炎(H120株)活疫苗的耐热保护效果。结果表明A配方的耐热保护剂效果最好,使用该保护剂的疫苗表现为37℃放置10d后,病毒含量下降在0.6~0.8个滴度。     

鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗耐热保护剂筛选和优化

应用冻干制品加速热稳定试验,测试7组冻干保护剂配方对鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（LaSota株＋H120株）的耐热保护效果。试验筛选出用于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的耐热保护剂,使用该保护剂的疫苗表现为37℃保存10d,病毒含量下降0．4个滴度,常规疫苗下降2～2．4个滴度;25℃保存30d,病毒含量下降0．4～0．6个滴度,常规疫苗下降1．8～2．6个滴度。证明此保护剂具有良好的耐热效果。     

羊传染性脓疱病毒耐热冻干保护剂筛选及冻干曲线优化

采用冻干试验筛选出保护剂基础配方,再通过Plackett-Burman设计法筛选主要保护剂基质,然后通过Box-Behnken响应面分析法对羊传染性脓疱病毒(ORFV)耐热保护剂配方进一步优化,用冻干试验进一步验证筛选出1种针对ORFV保护效果最好的耐热冻干保护剂作为疫苗用候选配方。同时,依据前期试验获得的活疫苗冻干曲线,通过进一步优化,获得疫苗最佳冻干曲线。利用该冻干工艺冻干的疫苗,保护剂的保护率可达95.3%,且疫苗各项指标均达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》要求。经37℃保存7,15,30d病毒滴度分别下降0.46,0.70,1.00;2~8℃保存3,6,12,24个月病毒滴度分别下降0.10,0.10,0.40,0.60,证明此配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。本试验解决了ORFV细胞弱毒疫苗仅能在低温条件下保存和运输的瓶颈技术问题,使疫苗的储存、运输更为方便。     

鸡基因工程复合抗病毒制剂冻干保护剂的筛选

采用不同高压灭菌条件处理的不同比例的脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖以及维生素C组成的保护剂配方对鸡基因工程复合抗病毒制剂进行冻干,冻干后通过外观检查、pH值检测、复水性检测及效价测定比较筛选出了理想的冻干保护剂,之后将普通水剂型和冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂分别置于4℃、-20℃、-70℃条件下进行保存期试验,结果表明采用脱脂奶粉+蔗糖、脱脂奶粉+蔗糖+海藻糖+维生素C两种配方对鸡基因工程复合抗病毒制剂的保护效果最好,冻干后效价仍为220;普通水剂和冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂在-70℃保存条件下保存360天内效价均未降低,普通水剂分别于90天、180天后效价开始明显下降,而冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂的效价均无明显降低,稳定性良好。本研究初步筛选出了鸡基因工程抗病毒制剂的冻干配方,显著延长了其保存期,为鸡基因工程抗病毒制剂规模化生产和推广应用奠定了基础。     

鸡新城疫活疫苗耐热保护剂研究

应用冻干制品加速热稳定性试验,测试三组冻干保护剂配方对鸡新城疫(LaSota株)活疫苗的耐热保护效果。结果表明3号配方的耐热保护效果理想,主要表现为剩余水份含量低,37℃保存不萎缩,各种温度下保存病毒损失量低。     

羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护剂初步优化筛选试验研究

试验以羊传染性脓疱皮炎弱毒活疫苗为对象,依据冻干保护剂的保护功能,对耐热保护剂的组成、混合比例进行了初步筛选。通过反复试验,对其物理性状观察、水分含量测定、冻干前后病毒损失量、经37℃处理、25℃保存后病毒损失量等指标的比较进行筛选,优选出了符合要求的A3、A6、C4三个耐热保护剂配方。试验结果表明,使用保护剂的羊口疮疫苗在37℃保存20 d,病毒含量下降0.5~0.7个滴度,常规疫苗下降2.3个滴度;25℃保存60d,病毒含量下降0.3~0.6个滴度,常规疫苗下降2.5个滴度。从而证明了羊orf耐热活疫苗耐热效果优于常规疫苗。     

猪伪狂犬病活疫苗（TP株）冻干保护剂筛选和冻干工艺的优化

通过调整蔗糖明胶保护剂中蔗糖和明胶的比例、调整病毒液和冻干保护剂的添加比例,确定蔗糖添加量为40%、明胶添加量为8%配制的保护剂,病毒液与其按8∶1的比例冻干的制品性状较好,病毒含量较高。分别采用速冻法和慢冻法对制品进行冻干,结果表明,速冻法冻干后样品性状较好,病毒含量较高,因此确定采用速冻法对样品进行冻干。对预冻时间、一期干燥第一步干燥温度、干燥时间、加热的最高许可温度及时间进行了优化,结果表明,预冻时间1 h、一期干燥第一步干燥温度为5～10℃、干燥时间为14 h、干燥温度25℃维持4 h,为最优的冻干曲线。     

植物乳杆菌冻干保护剂的筛选及冻干工艺的研究

本试验对植物乳杆菌的冻干保护剂进行了筛选,同时对冻干工艺进行了优化。结果表明:最佳冻干保护剂配方是奶粉20%,海藻糖10%,甘油2%,低聚木糖5%;最佳的预冻温度和时间分别是-70℃,6 h;菌泥与水不同比例混合冻干后,随着水分的增加,植物乳杆菌的存活率缓慢下降,建议水与菌泥最佳比列为0.5:1。经过冻干保护剂和冻干条件的优化,植物乳杆菌的存活率达到80%以上。     

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的研究

为了解耐热冻干保护剂在猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中的应用效果,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)分别与耐热冻干保护剂和常规冻干保护剂进行配比、冻干,制备疫苗,分别将疫苗置2~8℃保存,定期测定其效价,同时进行37℃、25℃耐老化试验。结果显示,疫苗在2~8℃条件下保存24个月,耐热苗效价下降不超过0.5个滴度,常规苗效价下降超过3.0个滴度;37℃保存10d,耐热苗效价下降不超过0.5个滴度,常规疫苗下降超过2个滴度;25℃常温保存2个月,耐热保护剂疫苗效价下降不超过0.35个滴度,而常规苗效价下降超过2个滴度。试验结果表明,耐热冻干保护剂对病毒的保护效果明显优于常规冻干保护剂,具有良好的热稳定性。     

鸡痘耐热保护剂活疫苗的研究

选择不同基质组成保护剂与鸡痘抗原进行冻干试验，试制一种适宜鸡痘弱毒株的耐热冻干保护剂。应用耐热冻干保护剂和专用的冻干曲线，制成鸡痘耐热保护剂活疫苗，经37℃保存10d的耐老化试验，每羽份病毒含量下降0．2—0．4个滴度；疫苗在2—8℃保存24个月后，每羽份病毒含量下降0．2-0．4个滴度，且均≥10^3.0EID50／羽，具有良好的热稳定性。19万羽的田间试验证明，鸡痘耐热保护剂活疫苗安全、有效。     

植物乳杆菌WL-R-02冻干保护剂配方的优化

以植物乳杆菌WL-R-02为研究对象,将冻干存活率提高到90%以上。通过正交试验法对现有的保护剂成分进行优化,筛选出最优保护剂组合。获得的最佳保护剂配方组合为：脱脂乳粉13%,海藻糖4%,乳糖3%,L-半胱氨酸1%;以最佳复合保护剂配方对植物乳杆菌WL-R-02进行-40℃预冷冻2 h,-30℃,20 Pa条件下冷冻干燥38 h,活菌数为6.70×10¹⁰CFU/g,冻干存活率91.6%,4℃冷藏保存10 d,活菌数为6.63×1010CFU/g。该研究可为开发商品化专用直投式发酵菌剂提供技术支撑。     

鸡传染性支气管炎耐热活疫苗的研究

应用鸡传染性支气管炎病毒(H52株)与不同耐热保护剂配方和冻干曲线进行筛选.结果表明:采用冻干曲线2和耐热保护剂WXS冻干鸡传染性支气管炎病毒H52弱毒疫苗效果最佳.试制耐热活疫苗3批,其各项检验均符合要求.耐老化试验表明:经过37℃放置10d的每羽份病毒含量下降0.6～0.8个滴度,每羽份病毒含量达104.7～105.1EID50.保存期试验表明:2～8℃保存24个月疫苗每羽份病毒含量下降0.4～0.6个滴度,每羽份病毒达104.1～104.3EID50.疫苗2～8 ℃保存24个月后效检抗体水平达到1:16～1:32.免疫持续期试验表明:免疫21日龄SPF鸡,6个月后血清中和抗体效价达到1:32～1:64.田间试验表明临床观察无不良反应,安全有效.特异性试验表明耐热活疫苗抗原性不变.耐热保护剂生物学和理化特性表明保护剂安全、稳定,室温保存期达3个月.     

一株禽大肠杆菌噬菌体发酵工艺及冻干保护剂配方优化

本研究以禽大肠杆菌噬菌体Ecp-2为研究对象,对其发酵工艺进行优化,并采用正交试验筛选该噬菌体的冻干保护剂。结果表明:发酵工艺经优化后发酵液噬菌体效价可达(10~(10)pfu/mL),较原发酵工艺提高1个数量级以上。冻干保护剂配方为脱脂奶粉15%、海藻糖9%、硫代硫酸钠5%、谷氨酸钠3%,噬菌体无菌过滤液采用摸索出的最优保护剂配方进行真空冷冻干燥,存活率可达75%,冻干粉效价(10~(11)pfu/g)。冻干粉在-20℃及4℃贮存180d,效价无明显损失。本研究为提高噬菌体制剂效价及延长噬菌体制剂货架期提供数据支持。     

植物乳杆菌BLPS-9中试发酵工艺优化及冻干保护剂筛选

本研究以植物乳杆菌BLPS-9为研究对象,对其中试发酵工艺进行优化,采用正交因素对其保护剂配方进行筛选。结果表明:经优化后植物乳杆菌BLPS-9中试发酵液活菌数可达50×10^8 cfu/mL,确定最佳离心条件10000 r/min、离心10 min活菌数最高,保护剂配方为脱脂奶粉25%、海藻糖7.5%、甘油0.75%;在最适离心条件下采用最佳冻干保护剂进行冷冻干燥,植物乳杆菌BLPS-9存活率可达91.01%,菌粉活菌数为6.0×10^11 cfu/g。在4℃和-20℃条件下贮存28 d,活菌数无明显损失。本研究为进一步提高乳酸菌制品的货架期提供了参考。     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

响应面法优化猪伪狂犬病病毒耐热保护剂的研究

为提高猪伪狂犬病活疫苗的保存温度,本实验应用响应面法(RSM)筛选并优化出猪伪狂犬病病毒(PRV)耐热保护剂最佳配方。结果表明:谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐和D-山梨醇能够显著提高病毒对冻干环境的耐受能力,酶解酪蛋白、海藻糖、明胶、蔗糖和牛血清白蛋白显著性依次递减;以冻干后病毒保护率为响应值,响应面优化出最优配方为:谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、D-山梨醇2%、酶解酪蛋白7.6%、海藻糖1%、明胶4%、蔗糖15.2%、牛血清白蛋白2%。采用该配方进行验证试验,冻干保护率达到80.40%,经37℃保存7 d的耐老化试验及2℃~8℃保存24个月,3批疫苗病毒滴度分别下降0.55、0.62、0.47及0.47、0.51、0.41,证明该配方制备的疫苗具有良好的热稳定性。     

猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达.通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化.采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性.结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因.嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上.rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104 IU·mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U·mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应.这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础.     

一种复方中药冻干粉的制备及其安全性研究

目的:将一种传统复方中药制备成冻干粉,并对其进行安全性评价。方法:采用单因素试验,对保护剂的种类和用量、药品冻干浓度进行筛选,并以绿原酸、表告依春及苦参碱含量作为冻干粉质量的主要考察指标;采用正交试验方法,以冻干率为考察指标确定最佳冻干工艺参数;通过溶血性试验和过敏性试验考察其安全性。结果:20%药液中加入10%甘露醇,在冷冻机中-50℃预冻5 h、-20℃低温升华干燥14 h,30℃解析干燥10 h,冻干样品25℃条件下放置12个月稳定性良好,安全性检查无溶血和过敏反应。结论:该冻干粉处方合理,制备工艺方便可行,质量安全可控。     

鸡新城疫La Sota 系冻干苗新型保护剂的研究 Ⅰ.鸡新城疫 La Sota 系新型保护剂冻干苗室温保存期试验

为保证鸡新城疫ＬａＳｏｔａ系冻干疫苗的质量、便于疫苗的运输和保存，根据冻干疫苗保护剂的作用原理［１，２］，将几种必要的保护剂进行不同组合作为保护剂，冻干出鸡新城疫ＬａＳｏｔａ系疫苗。经试验，初步选择出一种保护剂配方。冻干的鸡新城疫ＬａＳｏｔａ系疫苗，经室温（２５～３０℃）保存试验，该疫苗耐稳定性明显优于蔗糖脱脂乳保护剂冻干苗。室温保存３０天，效价仍合格，而蔗糖脱脂乳疫苗室温保存有效期仅为１０天     

响应面法优化含活性肽CC34毕赤酵母重组菌冻干营养保护剂的研究

【目的】利用响应面分析法优化含活性肽CC34毕赤酵母重组菌的冻干营养保护剂组合配方。【方法】通过单因素试验,筛选脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇和谷氨酸钠提高毕赤酵母重组菌存活率的最佳范围;利用Box-Behnken法建立毕赤酵母重组菌存活率回归方程,分析3种保护剂组合对菌体存活率的效应关系。【结果】脱脂乳粉浓度为10%时毕赤酵母重组菌冻干存活率最高,达到51.23%;海藻糖浓度为15%时冻干存活率最高,达到67.50%;山梨醇浓度为20%时冻干存活率最高,达到52.19%;谷氨酸钠浓度为3%时冻干存活率最高,达到36.92%。通过响应面法获得含活性肽CC34毕赤酵母重组菌冻干保护剂组合中脱脂乳粉、海藻糖、山梨醇的浓度分别为10.75%、15.70%、20.19%,通过最优模型预测毕赤酵母重组菌的存活率为77.00%,应用此最优保护剂组合进行冻干试验,菌体冻干存活率为78.98%。【结论】本试验通过响应面法优化了毕赤酵母重组菌复合冻干保护剂配方,在脱脂乳粉浓度为10.75%、海藻糖浓度为15.70%、山梨醇浓度为20.19%条件下,可获得较高的菌体冻干存活率(78.98%)。该复合冻干保护剂可用于含活性肽CC34毕赤酵母重组菌的保存和后续试验研究。