抗传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

前言 1925年鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngo-tracheitis,ILT)首次发生于美国洛岛,是鸡的一种病毒性呼吸道传染病,该病可引起鸡死亡和产蛋下降,目前在多数国家仍有流行,对养禽业造成了严重的危害。疫苗接种是防制本病的一条切实可行的措     

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病.在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件.在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护.在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体.这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播.     

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所与哈尔滨维科生物技术公司经过多年的课题攻关，研制而成的世界上第一个传染性喉气管炎的活载体疫苗，该疫苗目前已经获得农业部颁发的新兽药(二类)证书(农业部公告第461号)，是世界上第一个达到国际疫苗应用标准，并且完全拥有自主知识产权的禽痘病毒活载体疫苗。     

传染性喉气管炎鸡痘基因工程疫苗

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病,疫苗接种是防制本病的一条切实可行的措施。然而常规弱毒疫苗存在毒力偏强,接种后反应大,也能导致潜伏感染,在鸡体间传播可使毒力返强,使免疫鸡群有可能成为潜在的传染源,且该病毒强、弱毒无鉴别诊断方法等缺点。基因工程疫苗不仅很好地解决了这些问题,而且具有以下特点。     

鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗免疫效果试验

用鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗、英特威鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗分别免疫鸡群后,观察接种反应并做免疫保护力试验。结果表明,鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗几乎没有接种反应,基因工程疫苗与英特威疫苗对ILT免疫保护率是相同的。一般鸡群通过两次的疫苗免疫接种5个月后,对ILT的免疫保护率能够达到100%。通过对鸡传染性喉气管炎重组鸡痘基因工程疫苗田间试验和区域试验结果表明,用该疫苗免疫鸡群,不仅接种反应小、安全、能有效地防止ILT的发生,而且由于鸡群几乎没有接种反应,育成期死淘率低,鸡群生长发育整齐,在产蛋期能表现优良的生产性能。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的安全性试验与最小免疫剂量测定

将表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-ILTVgB)通过鸡胚成纤维细胞培养,加入适当的保护剂制成冻干疫苗.取3批冻干疫苗,生理盐水稀释后分别经翅内侧无血管处皮下接种14日龄和50日龄SPF鸡,接种剂量为5 × 106PFU,接种后3天出现局部反应,5天局部肿胀达到最大,接种鸡无其它全身反应,精神、食欲以及发育等均不受影响,说明重组病毒对试验鸡是安全的.取其中的200003批疫苗,用生理盐水作210-2～210-5稀释后,翅内侧无血管处皮下接种40日龄SPF鸡,免疫后4周分别攻击传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株,结果表明,重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力,在接种剂量为210-2～210-40.1ml/鸡的范围内可以使全部试验鸡产生局部反应,当接种剂量为210-50.2ml/鸡时可以使部分试验鸡(5/15)产生局部反应,鸡体对重组疫苗的最小反应剂量为210-40.1ml(相当于1000PFU).攻毒试验结果进一步证明,当接种剂量为210-40.1ml(相当于1000 PFU)时可以使免疫鸡产生可靠免疫力,抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和鸡痘病毒102株的攻击,降低鸡群的发病率和病死率.这些结果说明,疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性,疫苗对接种鸡的局部作用反应了疫苗的免疫效力,我们研制的重组疫苗的最小免疫剂量为1000 PFU,这就为我们进一步考察疫苗的免疫效力试验奠定了基础.     

传染性喉气管炎新城疫鸡痘重组病毒免疫效力的研究

在表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸡痘病毒(rF-PV-gB-F)安全性检验合格后,以5.0×101~5.0×104PFU不同含量按0.1mL/鸡的剂量免疫100只30日龄SPF鸡,30d后分组分别用ILTVWG株和NDVF48E9株强毒进行攻击。免疫鸡抗鸡痘病毒抗体都转为阳性,痘反应和接种剂量有关,重组疫苗的最小反应剂量为50PFU。重组疫苗可以诱发对新城疫和传染性喉气管炎的保护,0.1mL/鸡的接种量在500~5000PFU浓度范围内的免疫效果最好,对于ILTV攻击的发病保护率在70%以上,对NDV强毒攻击的抗死亡保护率可以达到80%,这为进一步考察疫苗的免疫效力试验以及进行田间试验奠定了基础。     

鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗的研究与应用

论述了鸡传染性喉气管炎亚单位疫苗、基因缺失疫苗、重组病毒活载体疫苗、基因疫苗的研究和应用进展情况,表明应用基因工程疫苗免疫可以从根本上改变鸡传染性喉气管炎的防治现状,使传染性喉气管炎的根除成为可能。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性评价

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因重组鸡痘病毒（rFPV-ILTVgB)的稳定性，我们对重组病毒进行6代和16代克隆纯化，对纯化后的病毒通过转瓶连续培养传20代，结果发现第6代纯化病毒（rFPV-ILTVgB-C6)在传代过程中有白斑出现，说明病毒纯度不够；经过16代纯化的病毒（rFPV-ILTVgB-C16)对细胞的嗜性加强，病毒的效价进一步升高，20代传代后蓝斑率仍然为100％，PCR的检测进一步证明插入的外源基因能在病毒的长期传代过程中稳定地遗传。抽取病毒细胞传代过程中的第5，10，15，20代次的病毒翅膀内侧无血管处皮下接种2周龄SPF鸡，20天后分为两组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和鸡痘病毒102株攻击，结果不同代次的重组病毒均可以使免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒和鸡痘病毒强毒的攻击，鸡体内病毒传代试验表明，重组病毒在接种部位仅存在6天，之后就检测不到病毒，重组病毒通过SPF鸡连续传代，不存在病毒返祖的可能，由此可以得出一个结论：rFPV-ILTVgB在结构上和免疫原性上是稳定的，无论是在体外传代，还是在体内均可以稳定遗传，不存在因为接种重组疫苗而给免疫鸡群带来安全威胁的可能，完全可以作为疫苗毒株进行商品化开发。     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

鸡传染性喉气管炎病毒病原学和基因工程疫苗的研究进展

本文综述了鸡传染性喉气管炎病毒的病原学特点，并介绍了鸡传染性喉气管炎病毒分子生物学及基因工程疫苗方面的进展情况。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护.     

鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗研究进展

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotrac-theitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotractheitis virus,ILTV)引起的一种急性呼吸道传染病,其特征性病变是呼吸困难、气喘、咳出血样渗出物,喉部和气管粘膜肿胀,严重者会导致糜烂和出血[1].     

鸡传染性喉气管炎病毒SA2疫苗株免疫效力的研究

鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）疫苗株尿囊膜乳剂原液经点眼接种２、７和１５日龄雏,２日龄雏鸡组在接种后第７天有２０％（１／５）鸡出现眼睑肿胀和流泪等眼部反应,７日龄和１５日龄雏鸡组无明显临床变化。用该疫苗株乳剂原液点眼接种１月龄以上鸡眼部无明显反应,但通过气管接种后,２６．７％（４／１５）鸡表现出ＩＬＴ临床症状。试验用ＳＡ２株点眼接种免疫１月龄以上鸡,免疫组保护率为１００％（２０／２０）,对照组发病率为１００％（１０／１０）、死亡率为４０％（４／１０）。２、７和１５日龄雏鸡点眼毒力试验的３组鸡,于接种后２１～３４天用王岗株ＩＬＴ强毒攻击,１００％得到保护,而对照组鸡１００％发病。试验结果表明,ＳＡ２疫苗株是一株毒力温和、副作用小而且免疫效力好的疫苗用毒株     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与ChIL-2重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验

将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。     

新城疫病毒F基因与传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒免疫保护产生时间的测定

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB-F)的免疫产生期，将60只30日龄SPF鸡随机分为6组，以5d为间隔在试验开始第0、5、10、15、20d时选取10只进行免疫，经翅内侧皮下注射接种1000PFU rFPV-gB-F，另外的10只作为对照。在第1组免疫后的第25d，将不同日龄免疫组和对照组试验鸡再随机分为2组，分别用传染性喉气管炎病毒WG株和新城疫病毒F48E9株强毒攻击。结果表明，在rFPV-gBF免疫接种后第10d时，可以诱发抗gB的抗体，保护免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和新城疫强毒的攻击。由此确定，rFPVgB-F免疫产生的时间是接种后第10d。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。