H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒RT-PCR方法的建立

为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法,根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列,设计2条特异性引物,建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上,在裂解位点处设计1条引物,建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段,对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段,对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证,两者的符合率为100%。试验结果表明,该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7亚型流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒,对H7N9病毒,尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。     

猪流行性腹泻病毒野毒株及弱毒疫苗株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。     

新城疫强、弱毒株分子生物学鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别区分新城疫强、弱毒株,根据新城疫病毒F基因序列设计出并合成两对特异性引物,XsXq、XrXa,用来区分新城疫强毒株和弱毒株,其中XsXa可组合用来扩增新城疫所有毒株,利用这三对引物对新城疫病毒的F基因片段进行多联RT—PCR扩增,并对该多联RT—PCR检-测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明：这三对引物能特异性地扩增出新城疫强、弱毒株及NDV毒株的F基因片段,大小分别为259bpNDV（F48E9）、522bpNDV（LaSota）、757bp（NDV）,该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速、敏感、特异的鉴别诊断新城疫强、弱毒株的分子诊断方法。     

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR。对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板。利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100%。结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑。     

高致病性H7N9流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

2017年2月广东CDC首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株,该变异株在血凝素(HA)基因的裂解位点发生了插入型突变,从而成为对禽高致病性的H7N9流感病毒(HPH7N9)。因此,急需建立一种快速简便的H7N9流感病毒检测方法。根据HP-H7N9的HA基因序列,设计一组HP-H7N9特异性的RT-LAMP引物,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的RT-LAMP检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验。结果显示,本方法只对HPH7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到2.97×10~5copies(10-6稀释度)的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法操作简便,对设备需求较低,试验耗时短,反应结果可直接肉眼观察判读,适用于基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP-H7N9的快速筛查和监测。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.     

人感染H7N9病毒血凝素基因分析

为研究2015年人感染H7N9流感病毒血凝素基因变化带来的病毒感染力、致病力等特征变化,从GISAID和GenBank上获取我国2015年人感染H7N9流感病毒HA核酸序列,经BLAST在线比对后下载选用的2013年和2014年人、家禽感染H7N9流感病毒HA核酸序列;利用MEGA6.0分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA核苷酸序列同源性,构建系统进化树,探讨我国2015年人感染H7N9流感病毒HA基因变化和引起的病毒感染力、致病力变化。2015年人感染H7N9病毒HA蛋白均具有能使其与人呼吸道受体特异性结合的Q226L,各样本HA蛋白氨基酸替换位点比2013年样本氨基酸替换位点增多,2015年人感染H7N9病毒出现分化。新增的氨基酸变化可能加强了H7N9病毒对人的毒力,2015年人感染H7N9病毒出现分化并具有地域性特征。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒（NDV）基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物，建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示，强毒株可以扩增出442bp的特异性片段和671bp的通用片段，弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR，整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定，该方法最低能检测到100pg的NDV RNA。     

RT-PCR对新城疫病毒强弱毒株的快速鉴定

根据新城疫病毒(NDV)F蛋白基因结构的特点及强、弱毒株F蛋白基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,并将其配成3对引物,采用RT-PCR试验对来自鸡和七彩山鸡的9株NDV野毒分离株,F48E8和LaSota 2株标准强、弱毒株进行了快速鉴定;并将RT-PCR鉴定结果与NDV常规致病性试验结果进行了比较。结果表明,RT-PCR试验能够快速将11个参试毒株区分为强毒株和弱毒株,其结果与传统致病性试验测定结果基本一致,该方法可以用于ND的快速诊断和强、弱毒株的快速鉴定。     

3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

对近10年来在同一地区分离到的3株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增和序列分析,探讨H9N2亚型流感病毒变异情况.3个毒株的HA基因全长1 683bp,编码560个氨基酸;其裂解位点均为R-S-S-R,属于低致病力毒株;推导的HA基因氨基酸序列均含7个相同的潜在糖基化位点,受体结合位点为禽源性流感病毒特异性序列,左侧臂氨基酸均为NGQQG,右侧臂均为GTSKA.3个分离株与参考株核苷酸与氨基酸同源率均较高,仅有一些非关键位点突变.它们均属欧亚种系,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97代表株亲源关系较近.研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异.     

适宜动物饲料化利用的北方桑树品种筛选及收获技术研究

从桑树存活率、单株条数、叶条收获量、叶条品质和叶条比5个方面探讨不同桑树品种用于开发动物饲料的适宜性,为筛选适宜动物饲料化利用的桑树品种提供参考。经连续5年试验,发现所用杂交桑品种比嫁接桑品种存活率高、发条数多、收获量大,更适宜用作动物饲料。合理的桑条收获方式是:根据饲喂动物的营养需求和能量需求,结合桑树的生长状况,确定收获时期;根据桑树品种及栽植地气候环境条件,按照用树与养树相结合的原则,确定每年的收获次数。     

对泔水饲喂生猪行为行政处罚的探讨

为有效防控非洲猪瘟疫情,主管部门先后出台相关规定,严禁泔水喂猪。在执法实践中,围绕相关法律法规规定,各地对泔水喂猪行为处罚意见不一。《畜牧法》虽规定禁止从事畜禽养殖使用未经高温处理的餐馆、食堂的泔水饲喂家畜,但未明确此行为的具体处罚措施,法律震慑效果偏弱;泔水也并非《饲料和饲料添加剂管理条例》所称的饲料、饲料添加剂,不适合其处罚条款;认为非洲猪瘟防控期间,针对泔水喂猪行为,应按照《动物防疫法》相关规定进行行政处罚是科学可行的。本文进一步从完善立法、强化宣传、强化执法等方面进行了思考,以期为做好非洲猪瘟防控监督执法工作提供参考。     

河南省猪源沙门氏菌分离鉴定、血清分型及药物敏感性分析?

为了解河南省猪源沙门氏菌的血清分型和耐药性,从郑州、开封、焦作等5市生猪屠宰场抽取猪盲肠内容物样品840份进行沙门氏菌分离。采用PCR、BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定系统和血清凝集反应对分离菌株进行鉴定,并通过微量肉汤稀释法对分离菌株进行药物敏感性分析。结果显示:从840份样品中共分离沙门氏菌45株,分离率为5.36%(45/840);分离的沙门氏菌共分为6个血清型,其中德尔卑(Derby)沙门氏菌为优势血清型;分离的沙门氏菌对四环素、磺胺异恶唑、大观霉素、氨苄西林耐药较严重,耐药率分别为82.22%、75.56%、73.33%、73.33%。结果表明:河南省存在一定的猪源沙门氏菌污染,尤其是德尔卑沙门氏菌,需要重点加强控制;沙门氏菌耐药情况较为严重,应进一步规范养殖环节抗菌药物的使用。     

河北省承德市接坝地区畜间包虫病感染风险因素研究

为寻找河北省承德市接坝地区牛羊群包虫病潜在风险因素,对承德市接坝地区23个乡镇的184个养殖户进行风险因素问卷调查,并分析调查结果。结果显示,牛羊养殖方式粗放、犬粪不进行无害化处理、犬密切接触羊牛群、驱虫后没有对犬进行拴养是包虫病感染的重要风险因素。通过Hosmer-Lemeshow检验,证明建立的Logistic回归模型拟合较好。结果表明,养殖户加强牛羊管理,对犬合理驱虫,限制散养犬接触牛羊群对于降低包虫病感染风险具有重要意义。     

天津市某鸡场高致病性H7N9流感紧急流行病学调查

2017年5月13日,天津市某蛋鸡场出现疑似流感疫情,发病鸡伴有呼吸困难、咳嗽等症状,死亡率持续升高,经国家参考实验室确诊为高致病性H7N9流感疫情。为查找可能风险因素并提出防控建议,进行了紧急流行病学调查。结果显示,本次疫情袭击率为10.8%,车流、人流以及野鸟带毒入场可能是引起疫情的主要原因。本次疫情得到有效处置,未发生扩散。     

一例副猪嗜血杆菌病的诊断与防治

2018年7月20日,山东省泰安市某猪场新购仔猪发生以腹泻、消瘦、贫血、呼吸困难为主要临床症状的疾病,发病率和死亡率分别为26.80%(67/250)和19.20%(48/250),病死率达71.64%(48/67)。剖检发现,病猪全身淋巴结肿大、出血,心外膜、胸膜、肠系膜、脑膜以及肝、脾表面有多量纤维素性渗出物,肝、脾肿大。取病猪肝脏病料进行细菌分离和PCR检测,发现分离株与副猪嗜血杆菌NCTC4557株同源性为99.00%;琼脂扩散试验结果显示,分离菌株为副猪嗜血杆菌血清4型。结合临床症状、剖检病变及实验室检测结果,确诊该病例为副猪嗜血杆菌感染。药敏试验结果显示,该分离菌对头孢噻呋、恩诺沙星、多西环素、阿莫西林、氟苯尼考等药物敏感。随采用饲料内拌入5.00%的阿莫西林可溶性粉,对病猪肌内注射头孢噻呋钠进行治疗,同时对猪舍内外进行喷洒消毒,疫情因此得到有效控制。由此提示,猪场应通过加强饲养管理和生物安全管理,减少应激因素,合理实施疫苗免疫等措施预防该病发生;一旦确诊疫情,要根据药敏试验,选用高敏感药物进行治疗。     

消毒剂Neopredisan135-1对大熊猫西氏贝蛔虫卵的体外杀灭效果观察

西氏贝蛔虫是危害圈养大熊猫的主要寄生虫,西氏贝蛔虫卵是圈养大熊猫重复感染该蛔虫的来源,虫卵在外界环境中有着极强的生存能力。测定了消毒剂Neopredisan135-1对西氏贝蛔虫卵的体外杀灭效果,为圈养大熊猫西氏贝蛔虫的防控提供参考。将分离自大熊猫新鲜粪样中的西氏贝蛔虫卵通过消毒剂Neopredisan135-1不同浓度(2.5、5、10、20、40mg/mL)与不同作用时间(30、60、90、120min)处理后,将处理后的蛔虫卵和未用消毒剂处理的平行对照组一并置于25mg/mL的重铬酸钾溶液28℃温箱内,培养后在显微镜下观察虫卵的发育与死亡情况。结果发现,2.5mg/mL浓度组处理虫卵30、60、90min,其虫卵杀灭率均在50%左右;5mg/mL浓度组处理虫卵30min和60min,其虫卵杀灭率在74.71%～87.64%;而在10、20、40mg/mL浓度下处理30min其杀灭率均达到90%以上,10、20、40mg/mL的Neopredisan135-1对西氏贝蛔虫卵均具有较强的杀灭作用。考虑到成本、杀灭效果以及环境等因素,消毒剂Neopredisan135-1的推荐使用浓度为20mg/mL。     

广东省首例非洲猪瘟疫情的诊断与疫点消毒效果评价

2018年12月17日,广东省珠海市某定点屠宰场发生该省首起非洲猪瘟疫情。诊断中发现,因病程不同,感染猪的临床症状和病理变化存在一定的差异,并非全部表现典型症状。疫情发生后,珠海市防控非洲猪瘟等动物疫病应急指挥部立即严格遵照《广东省非洲猪瘟突发疫情应急处置预案》的规定,采取了扑杀、消毒、发布封锁令,划定疫点、疫区和受威胁区等处置措施;封锁期内,按照《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》规定,并参考联合国粮食及农业组织(FAO)技术标准,对疫点进行消毒,同时采集疫点内的环境样品,检测非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸,评估消毒效果,为解除封锁提供依据。本文为全国非洲猪瘟疫情排查、临床诊断和处置提供了参考。     

2型猪圆环病毒研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种基因组较小,但有较高进化速率的DNA病毒,其是影响养猪业经济发展的重要病原体。到目前为止,PCV2具有5种基因型-PCV2a到PCV2e,但对PCV2流行株的基因序列的检测发现,PCV2的基因型仍在持续的发展。自2012年以来,PCV2d基因型的圆环病毒在北美取代了以前主导的PCV2b基因型感染,同时在中国和韩国也有了类似的趋势。圆环病毒的新兴基因型,其毒力存在增强的可能性,基于PCV2a基因型制备的疫苗,是否对PCV2d基因型圆环病毒的感染具有保护作用,已引起各国学者的重视。本文通过对PCV2的生物学特性、抗体变异情况以及其基因进化情况进行综合的分析总结,从而为PCV2疫苗的开发与研制奠定理论基础。     

河南省某县羊群布鲁菌氏病横断面调查及感染风险因素分析

为了解河南省羊布鲁氏菌病流行现状以及羊养殖场感染风险因素,按照两阶段抽样检测方法,采集某县羊养殖场和散养村的羊血清样品,采用虎红平板凝集和试管凝集垂直试验进行布鲁氏菌检测。结果显示,该县散养村的羊布鲁氏菌病表观群体流行率为16.35%,真实群流行率为18.17%(95%CI:12.14%~24.20%),养殖场的表观群体流行率为22.22%,真实群流行率为25.60%(95%CI:13.87%~37.33%)。风险因素分析结果显示,“羊贩随意进出养殖场(OR=18.50,95%CI:1.82~188.39)”和“共用种公羊(OR=12.00,95%CI:1.11~129.42)”是该县羊养殖场感染布鲁氏菌的主要风险因素。结果表明,该县羊布鲁氏菌病流行较为严重,提示该县需要加强布鲁氏菌病防控,提高养羊场户的生物安全管理水平,加强散养村内种公羊的布鲁氏菌监测与净化,及时淘汰阳性羊。