鸡源致病性沙门菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测方法,设计3对特异性引物,第1对扩增沙门菌属特异性毒力基因invA 285bp片段,第2对引物扩增沙门菌鸡宿主特异性基因fliC 600bp片段,第3对引物扩增沙门菌质粒毒力基因spvR 507bp片段,经过对反应条件的优化,建立了检测鸡源致病性沙门菌的多重PCR方法。该方法可以特异扩增携带毒力质粒的致病性鸡沙门菌,而与大肠埃希菌、多杀性巴氏杆菌、痢疾志贺菌及普通变形杆菌均无交叉反应;对沙门菌菌液的检出下限为4.5×102 CFU/mL,对重组质粒标准品的检出下限为1.67×103拷贝/μL。应用所建立的方法对采集的223份临床疑似病料进行检测,结果检出invA基因阳性27份,占12.11%,其中invA+spvR基因阳性19份,占8.52%;invA+fliC基因阳性2份,占0.89%;invA+spvR+fliC基因阳性6份,占2.69%。表明所建立的多重PCR可用于鸡源致病性沙门菌的快速鉴别检测及流行病学调查。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

LUX^TM荧光PCR快速检测沙门氏菌的研究

本研究针对沙门氏菌invA基因的保守序列,设计特异的LUX^TM荧光标记引物,通过优化反应奈件和参数,建立可快速检测沙门氏菌的LUX^TM荧光PCR检测方法。结果显示,该方法高度敏感,其对纯菌的检测低限达到10^2cfu／mL,经6h增菌培养后检测,对样品液的检测低限达到1cfu／mL;特异性强,测试的全部13株沙门氏菌标准和参考菌株均呈阳性反应,测试的全部27株非目标菌均呈阴性反应;重复性好,定量检测批内和批间的变异系数均小于2％。应用本方法检测食品样品240份,结果检出阳性4份,与TaqMan荧光PCR和SN标准检测结果完全一致。本方法可在8h内完成对样品中沙门氏菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,且检测成本较低。     

鸭疫里默菌环介导等温扩增检测方法的建立

采用对应于鸭疫里默菌16SrRNA基因442~461bp序列的5条特异引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)反应体系,加入试剂盒提取的鸭疫里默菌DNA后,置63℃反应60min,通过监测反应液浊度判断结果。在此基础上,用煮沸10min的方法代替试剂盒提取DNA方法,并用显色方法代替浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果,通过敏感性、特异性、病原消长规律试验验证方法的准确性。另外,对临床采集的135只患病鸭的心血、脑组织、肝脏和心脏共540份样品提取DNA后,用LAMP和PCR进行检测,同时进行细菌分离和鉴定,比较各种方法检测结果的符合率。结果显示,菌液提取DNA后,LAMP和PCR方法最低分别可检测到2和10个CFU的鸭疫里默菌。菌液煮沸代替试剂盒提取DNA方法,使LAMP的敏感性降低5倍。显色法、浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果的敏感性和特异性相同。细菌分离法共获得201株鸭疫里默菌,且经LAMP与PCR法检测均呈阳性,LAMP与PCR法检出阳性样本总数分别为271和254份,LAMP方法阳性检出率高于PCR方法。建立的鸭疫里默菌LAMP检测方法具有较高的敏感性,进一步用菌液煮沸方法代替DNA提取法虽然使敏感性降低5倍,但节省了DNA提取步骤,再结合显色技术使反应结果直观可见,使其临床应用更加便捷。     

沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。     

猪急性腹泻综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒（SADS-CoV）的RT-PCR方法,根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列,设计了3对引物（P1、P2和P3）,通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测,筛选出最合适的引物,然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、rTaq DNA聚合酶浓度和循环次数等反应条件进行了优化。结果显示,P3引物对SADS-CoV特异性最好,与其他病毒无交叉反应。敏感性试验显示,该方法最低检测限可达9.55×102 copies/μL;重复性试验显示该方法重复性良好。运用建立的RT-PCR方法,对广东省的21份临床样品进行检测,结果检出SADS-CoV阳性样品4份,阳性样品的测序结果与其RT-PCR完全一致。结果表明,本研究成功建立了一种鉴定SADS-CoV的RT-PCR方法,且该方法具有检测快速、成本廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可以用于SADS-CoV的临床诊断。     

生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种可快速特异检测生鲜肉中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7的多重实时荧光定量PCR方法,试验针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和大肠杆菌O157:H7 wzx基因的保守序列分别设计引物和Taqman探针,建立多重qPCR反应体系,进行特异性、灵敏度和重复性研究,用该方法检测30份...     

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测.     

利用CRISPR/Cas12a技术快速检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立

为建立可用于临床检测猪胸膜肺炎放线杆菌(App)的方法,本研究根据App apxIVA基因3'末端保守区,设计CRISPR/Cas12a特异性gRNA,在gRNA序列与靶序列结合位点的上下游区域内,利用Primer Premier 5.0设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,利用RPA引物扩增靶基因apxIVA,通过gRNA识别特异性靶基因序列,激活Cas12a蛋白单链DNA酶的切割活性,根据免疫层析试纸条检测原理设计单链DNA报告分子,使用免疫层析试纸条检测体系内报告分子是否被切割进而实现对靶基因的检测。并通过各反应条件的优化建立了一种针对APP的检测方法。反应条件优化结果显示,最佳单链DNA报告分子浓度及gRNA浓度分别为500 nmol/L、100 nmol/L;最佳孵育缓冲液为10%聚乙二醇,最佳反应时间为30 min。该方法仅对App的检测为阳性,而对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、沙门氏菌、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒的检测结果均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示该方法对App重组质粒标准品的检测下限可达10拷贝/μL,比普通PCR方法敏感性高1 000倍;重复性试验结果显示,该方法对3个不同稀释度重组质粒标准品的批内和批间重复性试验检测结果均一致,重复性较好。对40份小鼠的肺脏病料样品进行检测,结果显示本研究建立的方法检出27份阳性样品,且通过试纸条即可直接观察结果。常规PCR方法检出25份阳性样品,二者的符合率为95%。本研究所建立的方法具有操作简单、快捷、结果直观,无需昂贵设备等优点,为现地快速检测该病原提供了一种切实可行的技术手段。     

环介导恒温扩增(LAMP)-检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu/mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

饲喂母猪不同类型和水平的有机铁对仔猪生长和贫血状态的影响

本研究旨在评估母猪饲料中添加两种不同水平螯合态的有机铁对仔猪生长性能和改善仔猪贫血效果的研究。选取体重相近、胎次相近、遗传结构一致、健康的二元杂母猪30头,随机分为5组。对照组1组,在基础饲料中添加硫酸亚铁100 g/kg;处理组2、3、4、5分别在基础饲料中添加甘氨酸亚铁80 g/kg和100 g/kg、复合氨基酸螯合铁80 g/kg和100 g/kg。结果表明,母猪饲料中添加有机铁甘氨酸亚铁100 g/kg和复合氨基酸螯合铁80 g/kg可提高21日龄断奶仔猪体重,分别提高12.26%和10.3%;母猪饲料中添加有机微量甘氨酸亚铁和复合氨基酸螯合铁可改善母猪生产时和产后21日龄以及仔猪初生和断奶后体内血液红细胞数量(RBC)、血液平均红细胞的体积(MCV)和血液中红细胞压积(HCT),其中母猪日粮中添加甘氨酸亚铁80 g/kg和复合氨基酸螯合铁100 g/kg组仔猪血液红细胞数量(RBC)在初生和21日龄断奶分别提高6.06%和9.29%;母猪饲料中添加有机微量甘氨酸亚铁和复合氨基酸铁都可提高母猪初乳和常乳中乳铁的含量,其中添加甘氨酸亚铁100 g/kg和复合氨基酸螯合铁100 g/kg组初乳中铁浓度分别提高276%和346%。综上,通过提高母猪乳中有机铁含量可提高初生仔猪体内的铁储存与代谢以达到仔猪抵抗贫血风险的作用。     

鸽副黏病毒灭活疫苗候选株aYQ的生物学特性研究

评价鸽副黏病毒(PPMV)致弱毒株aYQ的生物学特性,为研制鸽副黏病毒灭活疫苗奠定基础。将PPMV aYQ株经SPF鸡胚连续传代,建立种子批。测定各代次毒种的血凝效价(HA)和鸡胚半数感染量(EID50),并进行纯净性检验;测定毒种鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI);测定毒种对鸡胚和鸽的毒力、遗传稳定性和抗原相关性。PPMV aYQ株经SPF鸡胚传代至F10,HA效价为1∶256～1∶512,病毒含量为10-8.5 EID50/0.1mL～10-8.9 EID50/0.1mL,毒种各代次均无细菌、霉菌、支原体以及外源病毒污染;PPMV aYQ株的ICPI和IVPI结果均为0,MDT测定结果大于120h;以103倍稀释的PPMV aYQ株病毒液接种10日龄SPF鸡胚96h无死亡,无眼观病变。以106EID50/羽的剂量人工感染鸽,未见异常症状;PPMV aYQ株各代次F基因均未发生基因突变,F蛋白裂解位点氨基酸序列均为-112GRQGRL 117-;交叉血凝抑制试验和交叉中和试验结果表明,PPMV aYQ株与NDV La Sota株间存在明显的抗原性差异。鸽副黏病毒弱毒株aYQ能够在SPF鸡胚上稳定传代,且生物学特性稳定,免疫原性良好,可以作为鸽源副黏病毒灭活疫苗的毒种。     

北京地区中国荷斯坦牛性情遗传评估

旨在探究中国荷斯坦牛性情的影响因素,估计方差组分和遗传参数并揭示其遗传趋势。本试验收集北京地区2015-2017年13个奶牛场共9 016头健康泌乳牛的性情评分,采用logistic回归模型分析性情影响因素,利用DMU软件使用动物模型估计性情评分、直肠温度、日产奶量和繁殖性状(产犊到首次配种间隔、重复输精次数)的遗传力及其之间的遗传相关,并根据估计育种值分析其遗传趋势。结果显示,北京地区中国荷斯坦牛性情评分1分、 2分和3分比例分别为75.00%、19.25%和5.75%;胎次和场-评定人效应对性情评分有显著影响(P<0.05);性情评分估计遗传力为0.03,属于低遗传力性状,与重复输精次数为中度遗传相关(r=0.56),与产犊到首次配种间隔和直肠温度为中度负遗传相关(r=-0.30,r=-0.17),而与日产奶量为低度遗传相关(r=0.07);2001-2017年,北京地区中国荷斯坦牛性情遗传趋势总体上无明显变化。本研究是国内首次对奶牛性情进行遗传分析,为了解奶牛行为特征、实现平衡育种提供理论基础。     

不同模型估计中国荷斯坦牛生产寿命遗传参数

旨在估计中国荷斯坦牛生产寿命遗传参数,同时比较不同模型的预测可靠性和稳定性。本研究使用单性状动物模型、单性状公畜模型和多性状动物模型对北京地区29个牧场90049头中国荷斯坦母牛的生产寿命数据进行遗传参数估计,所有模型均考虑了场、出生年季、头胎产犊月龄组的固定效应,个体加性遗传效应(动物模型)或父亲遗传效应(公畜模型)的随机效应和残差效应。结果表明,单性状动物模型和单性状公畜模型估计的生产寿命遗传力分别为0.052和0.047,多性状动物模型估计的遗传力较为稳定,介于0.057与0.069之间,多性状动物模型的遗传相关在0.779~0.998之间。对于存在大量在群个体(删失记录)的数据,使用基于前三胎数据的多性状动物模型较为合适,模型预测稳定性更高。本研究对中国荷斯坦牛生产寿命进行了遗传评估,为提高牧场效益、实现平衡育种提供了理论基础。     

中国荷斯坦牛产后0～35d繁殖疾病遗传参数估计

旨在估计中国荷斯坦牛产后0～35d的繁殖疾病遗传参数。本研究收集了1993-2017年间北京地区27个场中国荷斯坦牛产后0～35d25 026条繁殖疾病记录,统计分析发病规律,采用阈模型和线性模型,以场年、胎次和产犊季节为固定效应,个体加性遗传效应和永久环境效应为随机效应得到遗传参数来探究中国荷斯坦牛产后0～35d繁殖疾病遗传规律,同时尝试单独对子宫疾病进行遗传参数估计。结果显示,奶牛产后0～35d繁殖疾病记录占整个泌乳期繁殖疾病记录的54%;使用线性模型和阈模型所得奶牛产后0～35d遗传力分别为0.015 2(0.001 9)和0.094 4(0.01),使用SAS计算两个模型繁殖疾病EBV排名秩相关达95%(P<0.01);在繁殖疾病中,子宫疾病占48%,且主要集中于产后0～35d,利用线性模型估计得到产后0～35d子宫疾病遗传力为0.010 7(0.001 6)。根据线性模型得到的EBV计算繁殖疾病遗传趋势,发现自2000年以来,公母牛繁殖疾病、子宫疾病估计育种值均呈现下降趋势。本研究结果可为中国荷斯坦牛繁殖疾病的遗传育种工作提供参考。     

犬细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速的犬细小病毒(CPV)检测方法,本研究针对CPVVP2基因保守序列设计一对能扩增574bp片段的特异性引物,对纳米PCR的退火温度、引物浓度等反应条件进行了优化,并对其特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,所建立的纳米PCR特异性和灵敏性良好,最低核酸检出量为2拷贝·μL^-1,其敏感性比常规PCR高1000倍。分别采用纳米PCR和常规PCR,对广西、北京、吉林送检的75份疑似CPV的临床样品进行检测,CPV阳性率分别为89.3%(67/75)和70.7%(53/75),表明该方法具有更高的敏感性,适用于CPV低含量临床样品的检测。本方法的建立为CPV感染的早期快速、灵敏、准确的诊断提供了新方法,为CPV的防控奠定基础,具有重大的临床应用意义和价值。     

圈养丹顶鹤血变原虫的流行调查研究

本研究于2013年1月至2015年10月采集3个鹤类饲养单位81份丹顶鹤样品、37种245份周边环境的其他鸟类样品,3个单位4种昆虫3948只进行圈养丹顶鹤血变原虫的流行调查研究。采用瑞-姬氏涂片染色镜检以及套式PCR检测血孢子虫cytb基因、测序分析比对等方法调查各地丹顶鹤血变原虫的流行情况。丹顶鹤样品中共检出血变原虫进化支2种,检出率为19.75%,其他鸟类样品的检出率为0.41%,吸血昆虫样品的检出率为1.05%;扎龙、向海的丹顶鹤和环境吸血昆虫、北京的鹈鹕感染同一个血变原虫进化支,并且该进化支是各类动物中检出率最高的血变原虫进化支。     

牛奶的中红外光谱相关变量遗传参数估计

旨在探究牛奶原始中红外光谱相关变量的遗传规律。本研究收集北京三元绿荷某牛场1 822头荷斯坦牛生产性能测定数据、中红外光谱数据和系谱数据,使用R语言(v3.51)、SAS(v9.2)、DMU(v6.0)等软件进行主成分分析和遗传参数估计,遗传参数估计使用的动物模型考虑了测定月份、胎次和泌乳天数的固定效应及个体加性遗传效应、永久环境效应的随机效应。结果表明,80%以上中红外光谱变量之间的相关系数达0.500～1.000,且3 574～3 521 cm^-1和3 630～3 618 cm^-1区域的变量变异程度较高。对中红外光谱的每个波数进行遗传参数估计,大部分波数的遗传力集中于0.010～0.030之间,处于中高遗传力的波数占比约为7%;随遗传力提高,吸光度增大、透射率降低,且变异系数降低。中红外光谱数据可用于探究牛奶成分的遗传规律,从遗传角度提高奶牛质量,为种牛选择提供参考。     

抗菌肽Sublancin与黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能调节作用的比较分析

旨在比较研究抗菌肽sublancin与黄芪多糖对环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能的调节作用。试验选取60只4～6周龄健康雌性BALB/c小鼠,随机分为6个处理组。正常对照组:第1—3天,腹腔注射生理盐水;第4—10天,灌胃生理盐水。其余五个处理组:第1—3天,腹腔注射CTX(80mg·kg-1);第4—10天,阴性对照组:灌胃生理盐水;低浓度抗菌肽组:灌胃4.0mg·kg-1抗菌肽sublancin;高浓度抗菌肽组:灌胃8.0mg·kg-1抗菌肽sublancin;黄芪多糖组:灌胃200.0mg·kg-1黄芪多糖;阳性对照组:灌胃10.0mg·kg-1左旋咪唑。所有处理均为每天一次,每次0.2mL。于试验第1天小鼠腹腔注射CTX前、第4天灌胃前和第11天对小鼠进行称重。第11天称重结束后,采集全部小鼠的外周血及脾,检测外周血生理生化指标、CD4+与CD8+数量和脾细胞的细胞因子mRNA表达等指标。结果表明,与正常对照组相比,阴性对照组中小鼠体重、外周血的红细胞、血红蛋白和白细胞含量显著降低(P<0.05),脾IL-2、IL-4和IL-6的基因表达显著降低(P<0.05)。灌胃后,与阴性对照组相比,黄芪多糖组和高浓度sublancin组体重无差异但有升高趋势,说明高浓度sublancin与黄芪多糖对小鼠体重有积极影响;低、高浓度sublancin、黄芪多糖组和阳性对照组中小鼠外周血的白细胞含量显著升高(P<0.05);高剂量sublancin组中小鼠外周血的红细胞和血红蛋白显著升高;低、高浓度sublancin和黄芪多糖组中小鼠外周血的CD4+显著升高(P<0.05);低、高浓度sublancin、黄芪多糖组和阳性对照组中小鼠外周血的CD8+显著降低(P<0.05);低、高浓度sublancin组中小鼠外周血的CD4+/CD8+细胞显著升高(P<0.05);低、高浓度sublan-cin、黄芪多糖组和阳性对照组中小鼠脾IL-4的表达均显著升高(P<0.05);高浓度sublancin、黄芪多糖组和阳性对照组中小鼠脾IL-2、IL-6的表达显著升高(P<0.05)。综合上述结果,适宜剂量的抗菌肽sublancin和黄芪多糖均可缓解环磷酰胺造成的免疫抑制。与200.0mg·kg-1黄芪多糖相比,8.0mg·kg-1抗菌肽sublancin对缓解环磷酰胺免疫抑制造成的细胞因子降低的效果更好。     

北京市28种地被植物光合特性的研究

为了筛选北京市耐荫绿化地被植物,选用28种地被植物,测定了其光合色素含量及光合特性,并对28种地被植物进行了聚类分析。结果表明:美国石竹、鼠尾草、‘原野’无芒雀麦、百脉根、‘纽一’多年生黑麦草、紫花地丁、‘Accent’多年生黑麦草、白三叶、蓝亚麻、桔梗及‘WL354HQ’紫花苜蓿中的叶绿素a/b比值较低。细茎冰草、美国石竹、蒲公英、日本苔草的光饱合点和光补偿点均较低,表观量子效率均在0.05以上。‘Accent’多年生黑麦草、老芒麦、普通高羊茅、‘科罗拉多’高羊茅、百脉根、鼠尾草的光饱和点均在1200μmol/(m^2·s)以上,光补偿点均在50μmol/(m^2·s)以下,同时总叶绿素含量均在0.8mg/g以上,表观量子效率均在0.05以上。将28种植物的光补偿点进行了聚类分析,当聚合距离为5时可将这28种地被植物分为3类,其中,光补偿点最大的是‘WL354HQ’紫花苜蓿、‘Companion’日本结缕草和蓝亚麻。