转基因棉花对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响

为评估转基因抗虫棉花对天敌的安全性,用取食常规棉(中棉所49)、单价棉(中棉所45)和双价棉(2009002)的棉铃虫幼虫饲喂草间小黑蛛,采用酶联免疫和分光光度计法研究转基因抗虫棉对草间小黑蛛生长发育及其相关酶活性的影响。结果显示,与常规棉花相比,单价棉花使草间小黑蛛4～5龄幼虫发育历期显著延长,对其余龄期影响不显著;双价棉花对草间小黑蛛1～3龄幼虫发育历期影响不显著,4～5龄幼虫发育历期显著延长,6龄后大量死亡。2种转基因棉对草间小黑蛛体重及其体内外源蛋白含量的影响均不显著,除谷胱甘肽-转移酶和单价棉处理的过氧化物酶外,对其它相关酶活性亦无显著影响。     

棉铃虫 JNKs 基因的克隆及表达分析

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族(mitogen-activated protein kinases, 丝裂原活化蛋白激酶)的重要成员, 具有参与昆虫抗逆反应等多种功能。为明确JNK在棉铃虫 Helicoverpa armigera 中的表达特性及其对Bt杀虫蛋白的应激与免疫反应, 本研究通过PCR克隆得到2个棉铃虫 JNK 基因 HaJNK1 和 HaJNK2; 生物信息学分析结果显示: HaJNK1和 HaJNK2基因开放阅读框分别为1 191、1 143 bp, 分别编码397、381个氨基酸。系统进化树分析结果表明棉铃虫 HaJNK1 与黏虫 Mythimna separata 聚为一支, 亲缘关系较近, HaJNK2与 家蚕 Bombyx mori 聚为一支, 同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术分析 HaJNK1 与 HaJNK2 在棉铃虫不同发育时期、不同组织中的表达量, 发现 HaJNK1 与 HaJNK2 在卵中表达量最高, 其次是雌成虫; HaJNK1 在性腺中表达量最高, 其次是唾液腺; HaJNK2 在头部表达量最高, 其次是性腺。取食Cry1Ac的4龄棉铃虫幼虫的中肠组织中, HaJNK1 与 HaJNK2 的表达量均显著升高。推测 HaJNKs 基因可能参与棉铃虫抵御Bt杀虫蛋白伤害的应激和抗逆反应。     

转基因棉对棉铃虫幼虫生长及中肠蛋白酶活性的影响

室内测定了转慈姑蛋白酶抑制素(API)基因棉对棉铃虫幼虫的抗虫活性及对中肠蛋白酶活性的影响。结果表明，以转基因棉饲养棉铃虫，对幼虫拒食率24h达76．49％，72h达80．57％，试虫体重在取食48h后显著下降，72h后较对照低54．04％。试虫取食转API基因棉后，中肠的强碱性胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性显著降低，取食24、48h后的强碱性胰蛋白酶酶活性分别只有对照组的68．1l％和55．89％；类胰蛋白酶活性分别为对照组的85．87％和64．61％；对弱碱性类胰蛋白酶活性不明显。显示转API基因棉对棉铃虫幼虫中肠蛋白酶的抑制作用与对棉铃虫生长发育的阻滞有良好的相关性。     

棉铃虫V-ATP酶亚基A基因克隆及表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase,V-ATP酶)亚基A对棉铃虫生长发育的影响及其在Bt杀虫机制中的作用,采用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫V-ATP酶亚基A基因序列,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在棉铃虫不同发育历期和幼虫肠道不同组织中的表达量;并比较了4龄幼虫取食含Cry1Ac蛋白饲料后中肠中该基因表达量的变化。结果显示,棉铃虫V-ATP酶亚基A基因全长2 578 bp(Gen Bank登录号KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。V-ATP酶亚基A高度保守,不同物种间氨基酸序列同源性大于90%。V-ATP酶亚基A在棉铃虫整个生育期都有表达,在4龄幼虫体内表达量最高,是卵期的3.00倍;在幼虫肠道不同组织中,中肠中表达量最高,是后肠中的2.65倍。4龄棉铃虫幼虫取食含Cry1Ac蛋白的人工饲料后,中肠V-ATP酶亚基A的表达受到抑制,表达量为对照的0.39~0.81倍。表明V-ATP酶亚基A基因可能参与棉铃虫的生长发育和代谢过程,并可能与抵御Cry1Ac的毒杀作用有一定关系。     

棉铃虫脂肪酸结合蛋白的克隆与表达

为深入了解棉铃虫Helicoverpa armigera脂肪酸结合蛋白HaFABP1在参与细胞内脂肪酸代谢过程中的功能,基于酵母单杂交结果从幼虫中肠cDNA中扩增得到HaFABP1的开发阅读框,构建重组菌株BL21-pET28a-HaFABP1,进行融合蛋白His-HaFABP1的诱导和纯化,并利用实时荧光定量PCR检测棉铃虫不同时期和组织中HaFABP1的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下棉铃虫6龄幼虫中肠组织内HaFABP1的变化情况。结果显示,克隆获得的棉铃虫HaFABP1为405 bp,编码134个氨基酸,相对分子量和等电点分别为15.08 kD和5.54;在37℃下用0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌株4 h后,得到约18.4 kD的可溶性蛋白His-HaFABP1,纯化后的融合蛋白条带单一且大小符合预期;HaFABP1在棉铃虫的脂肪体、中肠、体壁和头部中都有表达,在头部的表达量最低,在中肠中的表达量最高;HaFABP1在棉铃虫幼虫的每个发育时期都有表达,表达量总体呈现先降低后升高的趋势,4龄时最低而1龄时最高;10 mg/g 2-十三烷酮处理饲料饲喂棉铃虫6龄幼虫6 h和15 h后,中肠内HaFABP1的表达量与对照相比显著提高,且随着时间的延长逐渐增加。表明HaFABP1与棉铃虫的生长发育有关,并且有可能参与了昆虫的解毒过程。     

转基因棉和常规棉叶片对抗Cry1Ac近等基因系棉铃虫生长发育的影响

利用室内饲喂法,以抗Cry1Ac近等基因系棉铃虫为材料,比较转基因棉花33B和SGK321及其对照亲本DP5415和石远321对抗、感棉铃虫生长发育的影响。结果表明,抗性棉铃虫在取食常规棉叶后表现出一定的适合度代价。取食DP5415和石远321两种常规棉花后,抗性品系棉铃虫的幼虫存活率显著低于敏感品系,取食33B和SGK321两种转基因棉花的抗性棉铃虫,不仅其幼虫存活率显著高于敏感品系,而且致死中时间也比敏感品系延长。取食9天后,抗性品系在常规棉花石远321和DP5415上发育到3龄和4龄幼虫的比例显著低于敏感品系,取食33B和SGK321转基因棉花的抗性品系发育到3龄幼虫的比例均显著高于敏感品系。抗性品系在常规棉上的蛹重均显著低于敏感品系,部分取食转基因棉花的抗性品系棉铃虫可以化蛹,而敏感品系不能在转基因棉花上化蛹。     

转Bt基因棉花杀虫蛋白含量的时空表达及对棉铃虫的毒杀效果

用ELISA法和室内生测法研究分析了3个转Bt基因棉花株系新棉33B、GK12、GK2不同生育期、不同组织器官的杀虫蛋白表达量、校正死亡率及它们之间的关系.结果表明,杀虫蛋白表达量在棉花生育过程中有明显的时空动态变化.总的趋势是苗期和蕾期杀虫蛋白表达量较高,花期呈下降趋势,花铃期下降最为明显,到铃期和吐絮期含量略有回升.不同组织器官的杀虫蛋白表达量也有显著的差异,其顺序为叶＞铃、花心、花萼、蕾＞花瓣＞苞叶.室内生物测定棉铃虫幼虫校正死亡率与其杀虫蛋白表达量高度一致.转Bt基因棉花应加强中后期对棉铃虫的监测和补充化学防治.     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用

为明确N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m⁶A）修饰在棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV）侵染棉铃虫中的作用,根据基因组和转录组数据,对棉铃虫m⁶A结合蛋白基因YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）进行鉴定和分析,利用实时荧光定量PCR技术检测棉铃虫YTHDF1基因的时空表达模式、HearNPV处理后的表达变化情况以及RNA干扰效率,并调查该基因下调后对HearNPV复制及感染HearNPV棉铃虫死亡情况的影响。结果显示,棉铃虫YTHDF1基因开放阅读框全长为2 019 bp,编码672个氨基酸,含有1个保守的YTH结构域,其氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura同源物序列一致性达87.52%。YTHDF1基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在进入5龄期24 h幼虫中的表达量最高,在2龄取食期幼虫中的表达量最低。YTHDF1基因的空间表达谱呈现一定的组织特异性,在幼虫血细胞和成虫头部的表达量最高。HearNPV侵染棉铃虫后YTHDF1基因上调表达,经RNA干扰使该基因下调后显著抑制了HearNPV多角体蛋白基因polyhedrin的表达并延迟了感染HearNPV棉铃虫的死亡时间。表明YTHDF1基因在HearNPV侵染棉铃虫的过程中发挥着重要作用。     

烟芽夜蛾囊泡病毒3h株3h-122基因于棉铃虫幼虫体内的转录表达分析

本文构建了烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(HvAV-3h)第122个基因(3h-122)的原核表达载体并制备多克隆抗体?利用蛋白免疫印迹?RT-PCR?免疫组织化学染色等技术检测3h-122的转录表达时相以及组织特异性?结果表明, 3h-122编码大小16.1 kD的结构蛋白(3H-122)?HvAV-3h感染棉铃虫幼虫后3 h开始检测到3h-122的转录并稳定持续至第168 h?3H-122在棉铃虫感毒后24 h至168 h可持续检测到其表达?此外, 3H-122主要在脂肪体组织中表达?本研究为阐明囊泡病毒结构蛋白的功能及其在囊泡病毒致病机制中的作用奠定了基础?     

黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因(allatostatin,AST)在调控黏虫Mythimna separata(Walker)保幼激素(juvenile hormone,JH)中的功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902bp,开放阅读框378bp,编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33kD,等电点为9.25,具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明,黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高,头部其次,卵巢最低;黏虫头部AST表达量在7日龄最高,飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用,明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。     

棉铃虫5-HT1和5-HT2基因的克隆及表达模式分析

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是昆虫体内一种重要的生物胺,其通过结合特异性的G蛋白偶联受体在昆虫体内发挥不同的神经调控作用。本研究基于转录组测序数据结合RT-PCR技术鉴定克隆了棉铃虫5-HT受体基因5-HT1和5-HT2,采用生物信息学方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测了其在幼虫和成虫不同组织内的表达特征。结果显示,棉铃虫体内分别表达5-HT的2类受体基因：5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2B。系统进化树分析表明,棉铃虫5-HT受体基因分为3个不同分支,而5-HT1和5-HT2可明显分别分成2个不同分支,各分支均与家蚕和烟草天蛾5-HT相应受体基因具有较高的同源性。RT-qPCR结果显示,在幼虫期,4种5-HT受体基因都在头部显著高表达,成虫期除在脑部高表达外,在触角或腹部也有高表达。其中5-HT1A和5-HT1B在雌成虫触角表达量显著高于雄成虫触角,5-HT1A和5-HT2B在雌成虫腹部表达量显著高于雄成虫腹部,而5-HT1B在雄成虫腹部表达量显著高于雌成虫腹部。以上结果表明5-HT1和5-HT2...     

西花蓟马取食、机械损伤和外源物质诱导对番茄植株次生物质及西花蓟马解毒酶的影响

为阐明寄主植物番茄受害虫西花蓟马Frankliniella occidentalis取食、机械损伤及外源物质茉莉酸和水杨酸甲酯诱导后次生物质含量的变化,以及害虫如何通过调整体内解毒酶活性适应植物的防御反应,采用生化分析法测定了各诱导处理下次生物质黄酮、总酚和单宁含量及西花蓟马体内解毒酶多功能氧化酶(MFO)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CarE)活性的变化。结果表明:番茄叶片在各诱导处理下黄酮含量在36 h和48 h时均显著高于对照,相应时间段茉莉酸处理与水杨酸甲酯处理的黄酮含量升高最显著,分别达32.07 mg/g和31.76 mg/g;各诱导处理后24 h和36 h时,单宁和总酚含量均有不同程度下降,但总酚含量在48 h时显著升高,其中虫害处理增加最显著,达34.51 mg/g。取食各种诱导处理番茄植株6 h时,西花蓟马体内MFO活性均升高,AchE活性均受到抑制;取食除机械损伤外的其它诱导处理叶片6 h后,西花蓟马体内GSTs活性均被抑制,CarE活性均显著上升,其中取食水杨酸甲酯处理叶片的西花蓟马体内GSTs活性下降幅度最大,而CarE活性升高最显著,分别为3 882.35 U/mg和106.33 U/mg。表明各诱导处理不仅可以使番茄次生物质含量发生变化,诱导植株产生防御反应,也会使西花蓟马改变解毒酶的活性以适应寄主植物的诱导抗性,即寄主植物和害虫通过防御与反防御相互适应。     

棉铃虫雌成虫对16种植物的产卵偏好性及幼虫取食后的生存表现

为研究棉铃虫成虫寄主偏好性和幼虫取食后生存表现之间的关系,明确两者在决定寄主过程中的作用,我们测定了交配后的棉铃虫雌成虫对16种植物(棉花、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、茄子、烟草、黄瓜、胡萝卜、西芹、杨树、月季、菠菜、包菜、大葱)的产卵偏好性和幼虫取食这些植物嫩叶后的存活和发育情况。棉铃虫雌成虫选择在烟草、茄子、棉花、胡萝卜、番茄、辣椒、玉米、西芹、大豆和花生等10种植物上产卵,但只有取食西芹、烟草、番茄、大豆、棉花和胡萝卜等6种植物叶片的初孵幼虫能够完成幼虫阶段的生长发育、化蛹并羽化,且取食植物嫩叶的幼虫的存活率、发育历期、蛹期和蛹重均差于取食人工饲料的幼虫。以上结果表明,棉铃虫雌成虫产卵寄主与其幼虫取食寄主之间存在并非一一对应的关系,幼虫的生存表现限定了棉铃虫的寄主范围。     

水稻磷酸核酮糖激酶基因OsPRK克隆、亚细胞定位与诱导表达分析

为探究水稻磷酸核酮糖激酶基因OsPRK在水稻诱导抗虫反应中的功能,以水稻秀水110为材料克隆OsPRK基因的全长,通过生物信息学软件分析其序列特征,并应用实时荧光定量PCR技术分析OsPRK基因在水稻不同组织中的分布情况以及在虫害诱导、激素和机械损伤处理水稻中的表达特征。结果显示,水稻OsPRK基因序列全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子量为44.86 kD,具有1个磷酸核酮糖激酶保守结构域。OsPRK蛋白亚细胞定位结果显示其定位于叶绿体。OsPRK基因在水稻中的表达具有组织特异性,其在内叶、外叶、内叶鞘、外叶鞘和根系这5个组织中相对于内参基因ACTIN的表达量分别为35.83、20.53、6.25、3.21和0.03。与对照相比,二化螟Chilo suppressalis为害能够强烈抑制水稻茎秆中OsPRK基因的表达;褐飞虱Nilaparvata lugens怀卵雌成虫为害1.5、24 h、白背飞虱Sogatella furcifera怀卵雌成虫为害1、8、24 h以及机械损伤处理3、6、24 h均能显著诱导水稻茎秆中OsPRK基因的表达;而OsPRK基因的表达量在茉莉酸处理6、12 h时以及水杨酸处理0.5、1.5 h时被显著抑制,在茉莉酸处理48 h和水杨酸处理24 h时被显著诱导。表明OsPRK基因可能参与了水稻对害虫的诱导防御反应。     

外源茉莉酸和水杨酸甲酯对西花蓟马生长发育和种群动态的影响

为明确不同外源因子对菜豆的诱导抗性及对西花蓟马的影响, 研究了茉莉酸、水杨酸甲酯、西花蓟马为害、机械损伤诱导处理的菜豆对西花蓟马生长发育和种群动态的影响。结果表明外源茉莉酸、水杨酸甲酯、西花蓟马为害处理菜豆植株显著延长了西花蓟马未成熟期的发育时间, 较健康植株分别延长4.72、2.87和4.95 d, 也造成西花蓟马的存活率不同程度的下降。西花蓟马在机械损伤处理和健康植株发育时间差异不显著。不同处理均使西花蓟马种群数量明显下降, 并且茉莉酸的抑制作用最明显。因此, 外源茉莉酸和水杨酸甲酯诱导的菜豆可对西花蓟马生长发育和种群动态产生不同程度的影响, 且茉莉酸的诱导抗性要优于水杨酸甲酯。本结果对探索西花蓟马的防治新策略有一定的参考价值。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

甘蔗花叶病毒VPg蛋白的原核表达及其在玉米中的免疫定位

 利用RT-PCR方法从感染甘蔗花叶病毒北京分离株(SCMV-BJ)的玉米叶片中扩增得到VPg基因,将VPg基因连接到原核表达载体pET-28a上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,VPg在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子量为30 kD。将融合蛋白纯化后免疫兔子获得了特异性较高的抗血清。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1/4096。利用该抗血清对健康玉米和病毒侵染的玉米茎、叶脉和叶片进行免疫金标记,结果表明在茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁处有金颗粒。