甲基营养型芽胞杆菌G-1抗菌肽的分离及抑菌作用研究

为探索甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus G-1抑制番茄灰霉病菌的作用机制,采用HPLC、LC-MS等对其分泌的抗菌肽进行分离鉴定,通过扫描电镜观测抗菌肽对番茄灰霉病菌菌丝形态影响,借助RNA-seq研究抗菌肽处理番茄灰霉病菌3、5 d后的差异表达基因。研究结果表明：甲基营养型芽胞杆菌G-1产生的抗菌肽主要为伊枯草菌素A。经菌株G-1抗菌肽处理后,番茄灰霉病菌菌丝生长异常,菌体畸形肿胀,内溶物外渗。基因差异表达分析表明,有40个基因在2个时期均差异表达。GO、KEGG富集分析发现,与萜烯合酶、氨基酸跨膜转运相关的15个基因在各时期均上调表达,与细胞表面受体信号通路、氧化还原酶、果胶裂解酶、单加氧酶等有关的25个基因在各时期均下调表达,其中编码琥珀脱氢酶（SDH）的Bcin02g06840基因及编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的Bcin04g04450基因表达量显著下调。经qRT-PCR验证,8个差异表达基因的表达模式变化与转录组测序分析结果一致。研究表明菌株G-1抗菌肽可能通过抑制番茄灰霉病菌细胞膜组分中SDH、HMGR的合成抑制菌丝及孢子的生长。     

葡萄霜霉病生防菌甲基营养型芽胞杆菌T3的鉴定及其防治效果

为了获得对葡萄霜霉病具有拮抗效果的生防菌株,本研究通过平板稀释法从葡萄园土壤中分离细菌,采用离体叶片混合点样法筛选拮抗菌,并进行了田间防效试验。根据菌株的形态学及16S rDNA序列分析对其进行鉴定,并检测了菌株T3的代谢产物。在分离获得的31株细菌中,菌株T1-2和T3发酵液对葡萄霜霉病菌的室内抑制率与对照枯草芽胞杆菌CN181一致,均为100%;2次田间试验均表明,在7 d时,清水对照的病情指数增加值平均为44.3,菌株T3发酵液的病病情指数增加值平均为21.0,对葡萄霜霉病的相对防治效果为52.4%,与菌株CN181发酵液无显著差异。经鉴定,菌株T3为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus,且该菌株在代谢过程中可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等抑菌物质。研究结果表明,菌株T3对葡萄霜霉病菌具有强烈的抑制作用,并对葡萄霜霉病具有较好的防治效果。     

甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果及定殖能力

为了探明甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的防治效果及其定殖能力,本文利用盆栽接种试验研究了菌株AL7对棉花黄萎病的防治效果;将带四环素抗性的pGFP78质粒转入到菌株AL7中,分析了菌株AL7在棉花根围土壤中、根部组织内的定殖情况。结果表明,菌株AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果为77.1%。pGFP78质粒转入后对菌株AL7的生长没有明显影响,仍具有游动性和产生物膜。定殖检测结果表明,菌株AL7能够在棉花根围土壤中及根系组织内长期定殖,接种5 d时定殖数量最高,达6×10~6cfu/g土,接种80 d后根围土壤中的定殖数量仍维持在2×10~6 cfu/g,根系组织内的定殖量为6×10~4 cfu/g。利用激光共聚焦显微镜观察验证,接种7 d后菌株AL7已经进入到棉花根部的中柱鞘细胞,能够在棉花根内大量定殖。     

拮抗菌AL7的鉴定及其生防特性的初步研究

从新疆棉田中分离获得一株细菌AL7,利用形态观察、生理生化性状测定结合16SrDNA、gyrB序列分析对菌株AL7进行种属鉴定,测定了菌株AL7及其挥发性气体对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae的拮抗能力,利用酸沉淀法粗提菌株AL7的抑菌活性物质,并测定了该活性粗提物对棉花黄萎病菌生长及其孢子萌发的拮抗能力,利用薄层层析法对活性物质进行了初步分离。结果表明,菌株AL7为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus,该菌株对棉花黄萎病菌具有极强的抑制作用,分泌在PDA平板中的抑菌物质对病原菌的抑制持效期达14d以上,该菌株产生的挥发性气体对棉花黄萎病菌的抑制效果达59.2%;菌株AL7的脂肽粗提物对棉花黄萎病菌抑制率达到82.8%,能够充分抑制大丽轮枝菌孢子的萌发,抑菌圈直径为36.1mm,生物自显影分析表明,菌株AL7分泌的抑菌活性物质Rf值约为0.75~0.83,该菌株在防治棉花黄萎病方面表现出较好的应用前景。     

甲基营养型芽胞杆菌BM-24菜籽饼发酵液对粉蕉枯萎病防效研究

本研究通过盆栽试验测定甲基营养型芽胞杆菌BM-24菜籽饼发酵液、菜籽饼发酵液、甲基营养型芽胞杆菌BM-24 LB发酵液对粉蕉苗期枯萎病的防效以及植株生长的影响。结果表明,各种发酵液对粉蕉苗均有一定防病促生作用。第51 d结束试验时,添加菌株BM-24的菜籽饼发酵液、菜籽饼发酵液和菌株BM-24 LB发酵液3个处理的病情指数较接种病原菌对照(CK2)分别降低82、64和49,地上部分鲜重分别高出81.19、60.60、59.30 g,地下部分鲜重分别高出38.25、35.03、30.83 g,株高分别高出23.10、18.81、14.38 cm,土壤中病原菌浓度从105 cfu/g土分别降低至103、103、104 cfu/g土。各发酵液处理均能显著提高粉蕉苗保护酶活性、抑制叶绿素分解、降低根系电导率,其中接种病原菌,施用添加菌株BM-24的菜籽饼发酵液处理效果最显著,粉蕉苗叶片SOD、CAT、POD峰值时的酶活力为CK2的1.3、1.4和1.5倍,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素含量分别为CK2的2.7、2.3和2.6倍,电导率降低了31.9%;菜籽饼能显著提高菌株BM-24定殖效果,接种45 d时活菌数量提高了5.0倍。     

甲基营养型芽胞杆菌WF-3微粉剂的研制及对黄瓜炭疽病的防治效果

以甲基营养型芽胞杆菌WF-3为研究对象,通过对载体、润湿剂、分散剂、保护剂的筛选,确定了甲基营养型芽胞杆菌微粉剂的最佳配方。其最佳配方为：白炭黑10%,润湿剂K12 2%,分散剂NNO 2%,保护剂CMC 0.5%,煅烧高岭土85.5%。测定结果表明,甲基营养型芽胞杆菌WF-3微粉剂含菌量2.07×10¹⁰cfu/g,分散指数83.31%,润湿时间11.4 s,pH 6.8,杂菌率2.6%,含水率0.98%,细度通过率98%（≤8.13 μm）,热贮分解率为4.02%,产品各项指标均达到标准。盆栽条件下,甲基营养型芽胞杆菌WF-3微粉剂对黄瓜炭疽病的保护效果优于治疗效果,防效分别为77.38%和72.69%。     

甲基营养型芽胞杆菌BMF 04固态发酵条件优化及其对黄瓜幼苗生长的影响

甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus BMF 04是本实验室从连云港海域分离纯化得到的对多种植物病原真菌有较强抗菌作用的优良生防菌株.为进一步开发应用该菌株,以细菌总数和芽胞率为指标,通过单因素和响应面试验设计,优化固态发酵培养基配方和发酵条件,采用室内盆栽试验,测定发酵物对黄瓜幼苗生长...     

梨炭疽菌拮抗细菌CL01的鉴定及其抗菌活性

为挖掘可用于防治梨炭疽病的生防资源,从江苏句容梨园根际土壤中分离筛选到1株对梨炭疽菌具有较强拮抗效果的菌株CL01.基于菌落菌体形态、生理生化特征、16S rDNA和rpoB基因序列,该菌株被鉴定为奥托威类芽胞杆菌Paenibacillus ottowii.CL01能够抑制梨炭疽菌菌丝的生长,受抑制的真菌菌落边缘菌丝变...     

贝莱斯芽胞杆菌次生抗生物质的研究进展

贝莱斯芽胞杆菌广泛分布于自然界,其次生抗生物质丰富,具有开发新型生物防治剂制剂的潜力。其基因组含有多种抗生物质的生物合成基因簇,如表面活性素、丰原素、杆菌霉素D等脂肽类化合物,杆菌烯、大环内酰亚胺、艰难菌素等聚酮类化合物,以及杆菌素和杆菌溶素等。除杆菌素以外,贝莱斯芽胞杆菌的绝大部分次生抗生物质依赖4'-磷酸泛酰转移酶（Sfp）途径合成。本文归纳和总结了贝莱斯芽胞杆菌抗生物质的化学结构、生物合成基因簇及其调控机制以及他们在控制植物、动物和人类疾病上的应用,以期为今后利用贝莱斯芽胞杆菌及其代谢产物研发生防制剂或临床药物提供科学依据。     

柑桔绿霉病拮抗细菌的筛选、鉴定及其抑制效果

从采集的柑桔园根际土壤中筛选得到1株对柑桔绿霉菌Penicillium digitatum具有较强拮抗活性的菌株HC-03.该菌株对柑桔绿霉菌、柑桔青霉菌Penicillium italicum、柑桔酸腐菌Geotrichum candidum等12种水果病原菌均有不同程度的拮抗作用,表现出广谱抗菌活性.菌落形态观察、生理生化特性分析及16S rDNA 序列测定和特异性PCR检测结果表明,该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens.对沙糖桔的活体接种试验表明,菌株HC-03的发酵液、菌悬液及发酵滤液处理柑桔绿霉病的发生率均低于20%,病斑直径均在10mm以下.     

灰葡萄孢拮抗细菌的筛选

采集扬州、淮阴两地１６种常见植物根部土壤、根和叶片样本１８２份,分离纯化后得到细菌６３２株,抑菌圈法测定对灰葡萄孢有拮抗性的５８株,拮抗性稳定的１３株。其中拮抗性最强的Ｙ２－１１－１菌株为芽孢杆菌,抑菌圈直径达２９．７ｍｍ。接种试验表明,Ｙ２－１１－１以番茄叶片和果实灰霉病的防效分别达６８．７％和７５．０％。部分菌株对其他重要植物病原真菌也有一定的拮抗作用。     

灰葡萄孢拮抗细菌在番茄植物体表的定殖

通过耐利福平标记菌株回收，研究了灰葡萄孢拮抗细菌(地衣芽孢杆菌W10和多粘类芽孢杆菌W3、Y2—11—1)在番茄叶片和果实上的定殖能力及其影响因素。试验表明，拮抗细菌在较高浓度(10^7--10^9cfu/ml)下，定殖时间可达10—15d。接种灰霉病菌对拮抗细菌的定殖有一定影响，特别是在接种灰霉病菌1d后接种拮抗细菌和同时接种灰霉病菌与拮抗细菌的情况下，拮抗细菌的定殖能力显著下降，提示该类拮抗细菌的防病效果要好于治病效果。此外，温度较高(25—35℃)、湿度较大(RH95％一--100％)、12h光暗交替对拮抗细菌的定殖有利。     

番茄灰霉生防菌CQ的分子鉴定及其生防效果研究

菌株CQ是一株分离自云南省保山市昌宁县烟草根部的对番茄灰霉病具有较好防治效果的拮抗细菌。通过对该菌株进行形态特征观察、16S rDNA序列分析鉴定,确定菌株CQ为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。拮抗试验结果表明,菌株CQ能够显著抑制番茄灰霉菌的菌丝生长,使菌丝出现异常分枝和囊泡状畸形。1‰ CQ发酵滤液即可显著抑制番茄灰霉菌孢子的形成。室内生测结果表明,相比对照组,48 h无菌发酵滤液原液在离体叶片上对番茄灰霉病的防效可达100%,而其10、100倍稀释滤液则使发病率分别降低28.5%和21.3%,病情指数分别降低44.01和37.86。     

解淀粉芽胞杆菌MH71抗菌物质理化特性及对番茄灰霉病菌的抑菌活性

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens MH71是一株高效广谱拮抗活性菌株,明确该菌株发酵液中活性物质的理化特性和抑菌活性,为解淀粉芽胞杆菌生物农药开发应用奠定坚实的基础。本研究在对菌株MH71抑菌活性物质理化特性研究的基础上,以番茄灰霉病菌为供试致病菌,探究了抗菌活性物质对番茄灰霉病菌的抑菌作用;采用酸沉淀和硫酸铵沉淀分别获得脂肽类和蛋白类活性物质,SDS–PAGE电泳和HPLC分别对活性物质进行检测。该菌活性物质具有较强的耐热性和pH适应性,100 ℃处理60 min和121 ℃处理30 min后抑菌活性分别为原有活性的88.98%和79.60%,在pH 3～11时均有抑菌活性,且对紫外线、蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。该抗菌活性物质对番茄灰霉病菌菌丝的毒力测定结果表明,不同浓度发酵液处理的番茄灰霉病菌菌丝呈现出较多局部膨大或溢缩等异常菌丝。其发酵液经酸沉淀法得到抗菌脂肽类活性物质,经硫酸铵沉淀法得到抗菌蛋白,脂肽类的抑菌活性高于抗菌蛋白类物质,SDS–PAGE电泳检测,得到约40 kD的蛋白条带,HPLC检测表明该抗菌物质中有surfactin存在。     

格氏沙雷菌CNY-04对灰霉病菌作用机制及抑菌物质理化性质研究

从蔬菜根际土壤中筛选到一株生防格氏沙雷菌(Serratia grimesii)CNY-04,利用抑菌圈法测定其对灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)的抑制效果,通过抑制孢子萌发、影响菌丝正常生长试验对CNY-04的作用机制进行研究,并对CNY-04菌株相关性状及抑菌物质的理化性质进行了研究.结果表明,CNY-04菌株对灰霉病菌拮抗能力强且遗传稳定,抑菌圈直径达到34 mm; CNY-04可对灰霉病菌菌丝结构造成破坏;可显著抑制灰霉病菌分生孢子萌发,抑制率为99％;CNY-04菌株不产生硝吡咯菌素、氢氰酸及水解酶类,可产生嗜铁索和蛋白酶;抑菌物质具有较好的热稳定性和酸碱稳定性.抑菌物质由灰霉病菌诱导产生,与已报道的沙雷菌属的作用机理完全不同.     

黄瓜炭疽病拮抗细菌的筛选及其抑制效果

从连作多年的黄瓜根际土样中筛选得到1株对黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare具有较强拮抗活性的菌株WF-3。通过菌落形态观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析,该菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。活体盆栽条件下,该菌株对黄瓜炭疽病的防治效果为66.48%。两年的田间试验表明拮抗菌株WF-3培养物对黄瓜炭疽病具有良好的防治效果,防效分别为68.14%和73.70%。     

拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导

通过拮抗细菌多粘类芽孢杆菌W3、Y2和地衣芽孢杆菌W1 0诱导接种和灰霉病菌挑战接种试验 ,明确了 3菌株培养液和去菌液对番茄植株抗灰霉病的诱导作用。 3株拮抗细菌的诱导抗病效果为 2 3 .4%～ 64.5% ,其中W3诱导作用最强。W 3培养液及其去菌液处理后 5d ,诱导效果达最大值 ,且 1 2d后仍有诱抗作用。在 1 0 2 ～ 1 0 1 0 cfu/ml范围内 ,拮抗细菌的诱导活性随浓度增加而增强 ,以≥ 1 0 8cfu/ml的效果最好。拮抗细菌处理叶上部各叶片间诱抗效果无明显差异。     

禾谷镰刀菌拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens AX-3的分离鉴定及拮抗物质的鉴定

禾谷镰刀菌Fusarium graminearum可引起小麦赤霉病,该病严重威胁我国小麦的质量安全。本研究从生物防治的角度出发,分离筛选拮抗菌,研究拮抗菌的拮抗特性和拮抗能力。试验采用系列稀释法和平板对峙法从小麦样品中分离筛选获得禾谷镰刀菌拮抗菌AX-3,根据16S rDNA基因、gyrB基因序列构建的系统发育进化树以及生理生化特性结果,菌株AX-3被鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。通过平板对峙法测定拮抗谱,结果显示AX-3对多种镰刀菌属病原真菌都具有良好的拮抗特性,抑菌圈半径为17~32 mm,表明AX-3具有广谱的拮抗性能。采用柱层析及制备液相色谱法对AX-3中的拮抗物质进行分离纯化,然后使用高分辨质谱及核磁共振的方法对拮抗物质进行结构鉴定表明,解淀粉芽胞杆菌AX-3产生的一种抗菌物质为macrolactin A。     

草莓内生细菌的分离及草莓灰霉病菌拮抗菌的筛选鉴定

本研究从健康的草莓植株内分离到54株内生细菌,其中根、茎、叶组织中分离内生细菌种群密度为2.8×101～3.95×104cfu/g鲜重不等。通过对峙试验,得到5株对草莓灰霉病菌有强拮抗作用的菌株,占所分离内生细菌总数的9.26%。来自草莓叶的SL6菌株抑菌效果最佳,抑菌半径达15mm,无菌发酵液对草莓灰霉病菌菌丝的抑制率为97.6%,具有作为生防菌的应用潜能。经形态、生理生化和16SrRNA等分析测定,并通过MEGA4方法构建其16SrDNA系统发育树,将SL6菌株鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。