线粒体COI基因作为根结线虫条形码的适用性分析

为评估线粒体COI基因作为根结线虫(Meloidogyne spp.)DNA条形码的适用性,对收集的25个根结线虫群体的线粒体COI基因进行扩增、测序,检测其扩增和测序成功率。将测序获得的COI基因序列与Q-bank中下载的根结线虫COI基因序列共同进行比对分析,利用MEGA 6.0计算种内、种间遗传距离进行"Barcoding Gap"检验以及构建NJ系统进化树作聚类分析,检验COI基因对根结线虫的物种识别能力。结果表明:线粒体COI基因扩增和测序成功率极高,扩增成功率达96%,测序成功率为100%。种间平均遗传距离为0.126,远远超过种内平均遗传距离0.002的10倍,种内遗传距离与种间遗传距离存在明显的"Barcoding Gap"间隔区。系统发育分析显示,COI基因可有效分辨出本研究15种根结线虫中的10种,物种识别率约为67%。线粒体COI基因具有极高的扩增和测序成功率、较高的物种识别能力,且扩增片段长度适宜,符合物种鉴定DNA条形码基因的标准,可作为根结线虫候选条形码基因。     

基于mtCOⅠ基因的三种稻飞虱DNA条形码构建及应用

为构建白背飞虱、褐飞虱、灰飞虱3种稻飞虱DNA条形码,准确鉴定各虫态稻飞虱种类,随机选取35个供试虫体提取全基因组DNA,PCR扩增其中线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（mtCOⅠ）基因,分析所获得的基因组成特点,计算P距离值,构建系统发育树,并对稻飞虱若虫、卵进行种类鉴定。PCR扩增获得了长度为706 bp的稻飞虱mtCOⅠ基因片段,碱基组成特点种内、种间不同;3种稻飞虱的种间P距离值为25.53%~34.21%,种内为0~0.51%,种间值明显高于种内;系统发育树显示同种个体聚集在同一分支;同种卵、若虫的mtCOⅠ基因与已获得的成虫基因序列同源性最高值为100%,P距离值为0。研究表明,3种稻飞虱的DNA条形码可基于mtCOⅠ基因构建,且可准确鉴定各虫态。     

入侵种西花蓟马与本地近缘种花蓟马的双基因鉴定

快速准确的害虫种类识别是有效筛选天敌昆虫开展靶向性生物防控的关键。入侵种西花蓟马Frankliniella occidentalis与本地种花蓟马F.intonsa常同域同期同种寄主上发生,因体型小、形态相似,难以快速准确鉴定。本研究以mt DNA COI与r DNA ITS2基因为标记对我国10个采样点的西花蓟马和花蓟马开展分子鉴定研究。结果显示,当以COI或ITS2基因为靶标时,西花蓟马与花蓟马间的平均遗传距离分别为0.221和0.113,是种内遗传距离的22.1和18.8倍,且种内、种间遗传距离间无重叠,并在系统发育树上聚为独立的分支,表明2种基因均可准确区分西花蓟马和花蓟马。此外,基于COI基因构建的系统发育树,西花蓟马的各单倍型聚为了2个亚分支,并分别对应温室品系和羽扇豆品系,表明COI基因还可用于西花蓟马品系的识别鉴定。研究结果对近缘种花蓟马的快速鉴定、专食性天敌昆虫的筛选,及其生防效果评价具有重要意义。     

果园螟蛾总科部分种类DNA条形码鉴定

为检验DNA条形码在鳞翅目螟蛾总科蛾类鉴定中的可行性,对采自山西省太原市晋源区螟蛾总科26种78头蛾类标本分别提取了DNA,扩增了全部78头标本的线粒体cox1基因和其中75头标本的核糖体28S基因,并通过构建系统发育树、计算遗传距离及种间差异阈值等方法,对所有标本进行了鉴定和比较分析,检验了国际DNA条形码数据库BOLD(the barcode of life data)系统的鉴定成功率。结果表明,基于cox1基因和28S基因的系统发育树鉴定成功率分别为100.00%和97.14%,BOLD系统的鉴定成功率达到了67.94%。基于最大简约法、邻接法和最大似然法构建的系统发育树,鉴定结果均相同。基于cox1基因的种内遗传距离全部小于1.00%,种内种间的遗传距离形成明显的3.00%阈值现象。研究表明,cox1及28S基因均适用于供试螟蛾总科种类的鉴定,核糖体28S基因可以作为DNA条形码鉴定的辅助基因;BOLD系统数据库仍有待充实,且标本鉴定工作相对滞后;不同聚类分析方法对结果影响很小,其中邻接法计算速度快,更适合DNA条形码大数据的分析。     

四纹豆象及其近缘种基于COI基因的分子检测技术研究

四纹豆象是口岸检疫中经常截获的种类,本文以四纹豆象及其近缘种为研究对象,测定分析了COI基因516 bp碱基序列。序列分析结果表明:保守位点为353个,变异位点为163个,简约信息位点为134个,自裔位点为29个。基于Kimura 2-parameter模型分析遗传距离,结果显示:种内遗传距离介于0.001~0.013之间,平均遗传距离为0.008,种间遗传距离介于0.114~0.193,平均遗传距离为0.161。采用邻接法构建的COI基因序列系统发育树显示,同一物种聚为同一小支,且分支自展值均为100%。结果表明应用COI基因片段对四纹豆象及其近缘种进行分子鉴定具有可行性。     

基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定

为筛选合适的基因序列对镰刀菌属Fusarium真菌进行检测鉴定,以从不同寄主分离获得的11种57株镰刀菌为材料,选择nr DNA-ITS、EF-1α、mt SSU和β-tubulin作为候选基因,将序列获得的难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标,对测序获得的有效序列进行研究,筛选出该属的DNA条形码。结果表明:EF-1α基因具有较高的PCR扩增与测序成功率,为98.2%,较mt SSU和β-tubulin基因更容易获得序列片段;且种内与种间遗传距离重叠部分较少,除木贼镰刀菌F.equiseti种内遗传距离为0.029,大于黄色镰刀菌F.culmorum和禾谷镰刀菌F.graminearum种间遗传距离0.021外,种间差异明显大于种内差异,优于其它基因,能更好地区分镰刀菌;利用EF-1α基因序列构建的系统发育树显示,相同种聚集在同一分支,不同种划分在不同分支,鉴别能力较好;EF-1α基因不能扩增出其它6株非镰刀菌属的主要植物病原真菌,而对镰刀菌的PCR扩增效果很好,电泳检测结果条带单一、明亮。表明EF-1α基因可作为镰刀菌属鉴定的DNA条形码。     

基于DNA条形码的红翅大小蠹和黄杉大小蠹分子鉴定

外来有害生物的快速准确鉴定有助于提高口岸检疫效率。红翅大小蠹(Dendroctonus rufipennis)和黄杉大小蠹(D. pseudotsugae)作为大小蠹属的非中国种是我国口岸原木检疫中频繁截获的检疫性有害昆虫。本研究以mtDNA COI基因5′端和3′端序列为标记对红翅大小蠹与黄杉大小蠹的11个样本开展分子鉴定有效性评价。结果显示,当以COI基因5′端和3′端为靶标时,两种大小蠹间的平均遗传距离分别为0.181和0.144,是种内遗传距离的60.3和48倍,且种内、种间遗传距离间无重叠现象,在系统发育树上都能聚为独立的分支,表明mtDNA COI基因5′端和3′端序列均可有效区分红翅大小蠹与黄杉大小蠹。     

黑麦草属DNA条形码鉴定技术研究

以毒麦、田毒麦、多花黑麦草、多年生黑麦草、硬直黑麦草、高羊茅与狗牙根等禾本科的7种植物为材料,拟采用 DNA 测序、特异性位点比对、种间遗传距离测定、建立系统树等分析候选 DNA 条形码 psbA-trnH 鉴别黑麦草属常见植物的能力。实验结果表明,以 psbA-trnH 为 DNA 条形码时,建立的系统发育树能较好区分毒麦和田毒麦与其他几种植物。psbA-trnH 序列可以作为黑麦草属植物的潜在条形码。     

大穗看麦娘与日本看麦娘的DNA条形码鉴定

大穗看麦娘是我国麦田新发生的恶性杂草,与日本看麦娘苗期形态相近,导致难以识别和有效监测。本研究利用4个DNA 条形码候选序列(rbcL、matK、trnH-psbA和ITS2)对13份大穗看麦娘和10份日本看麦娘叶片材料进行分子鉴定,采用Vector NTI分析扩增的DNA序列峰图质量并比对碱基差异,通过MEGA 6.0软件中的K2P模型计算样本种内和种间的双参数遗传距离,采用邻接法构建系统发育树。结果表明,4个DNA 条形码序列中仅matK扩增测序结果不理想。日本看麦娘在4种DNA条形码序列中不存在种内差异,大穗看麦娘在rbcL、matK和ITS2序列中无种内差异,仅在trnH-psbA序列中存在7个差异位点。大穗看麦娘和日本看麦娘种间各DNA条形码序列均有差异,trnH-psbA、rbcL、matK和ITS2序列存在的差异位点数分别为6、3、14和28。ITS2的种间平均遗传距离大于rbcL,且具有特异性,适宜用于大穗看麦娘和日本看麦娘的准确鉴定。     

景天属多肉植物基于ITS条形码鉴定探析

在多个条形码基因研究的基础上,本研究以ITS序列为目的片段通过DNA条形码技术对口岸截获的景天属多肉植物进行快速鉴定。采用通用引物扩增景天属10种32个供试样本的ITS片段并双向测序拼接,利用MEGA7软件进行序列比对,分析种内种间K2P距离并作barcoding gap,构建系统发育树。结果表明供试材料ITS序列的种内变异明显小于种间差异,种内种间变异存在明显的间隔区,每种的所有样品在NJ树上严格聚成单系,种间区分明显。初步判定ITS具有作为景天属多肉植物DNA条形码的潜在可能。     

蓟马的分子鉴定和种群遗传学研究进展

蓟马是一类个体微小的昆虫,形态学特征观察困难,种内遗传多样性高,且部分害虫类蓟马寄主广泛,繁殖能力强,为害严重,已成为重要的农林类害虫。采用分子生物学手段对蓟马进行物种鉴定,可以解决传统形态学鉴定困难、局限性较大等问题,能提高物种鉴定的效率与准确性。目前,关于蓟马分子生物学鉴定的研究较多,其中,基于线粒体细胞色素氧化酶亚基（ I cytochrome oxidase I,COI）基因片段的DNA条形码技术被广泛用于蓟马的快速准确鉴定、属内近缘种的区分及不同品系或生物型的鉴别。此外,开展蓟马类害虫种群遗传学的研究不仅有利于全面了解其遗传分化、适应性、入侵来源和扩散路径,还可为制订合理有效的监测预报和综合防治策略提供理论依据。目前,多种蓟马的种群遗传学研究表明地理隔离、寄主植物和微生物等因素影响其种内和种间的遗传多样性和遗传分化。本文综述了国内外有关蓟马的DNA条形码鉴定与种群遗传学研究进展,对目前蓟马物种鉴定中存在的问题进行讨论,并对未来的发展趋势进行展望。     

DNA条形码在昆虫学中的应用

DNA条形码技术是通过对一段标准化基因DNA序列的分析来实现对生物物种准确、快速鉴定的技术。自2003年提出以来,DNA条形码技术便备受关注,不仅被广泛地应用于生物分类学研究,也为生态学等学科的发展带来了机遇。昆虫是动物界的最大类群,目前条形码数据库中超过65%的序列都来自昆虫纲,DNA条形码的发展无疑为昆虫学带来了勃勃生机。本文综述了DNA条形码的产生、发展、优势及局限,总结并展望了DNA条形码技术在昆虫学基础研究与实践方面的应用。     

火蚁属部分种类DNA条码技术研究初探

选取火蚁属(Solenopsis)部分重要种类——红火蚁、黑火蚁、热带火蚁与巴西火蚁等22个种群为研究对象,以COI基因片段作为分子标记,扩增了部分种类的目标片段。结合GenBank上发表的火蚁属种类的序列信息,应用序列比对与构建系统树等生物系统学的研究方法,重建了火蚁属部分种类的系统发育关系。邻接系统发育树(Neighbor-Joining tree)分析结果表明,COI基因片段适合作为火蚁属种类鉴定的条码基因。     

世界主要储粮书虱环介导等温扩增试剂盒研发与应用

为利用分子生物学技术快速准确鉴定国内外主要储粮书虱,基于环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术拟研发一款世界主要储粮书虱LAMP试剂盒,利用该LAMP试剂盒对10种储粮书虱的DNA粗提液进行测试,并结合DNA条形码技术对采自中国山东省和内蒙古自治区粮库的未知种类储粮书虱成虫样品进行鉴定。结果显示,本试验研发的LAMP试剂盒可准确鉴定10种储粮书虱;使用LAMP试剂盒和DNA条形码技术鉴定未知种储粮书虱样品的结果一致,即山东省储粮书虱样品为嗜虫书虱 Liposcelis entomophila,内蒙古自治区储粮书虱样品为啮书虱 L. corrodens,表明本试验研发的世界主要储粮书虱LAMP试剂盒可以快速、精准完成主要储粮书虱的鉴定,且操作便捷,可为海关口岸和基层仓储保护部门书虱鉴定工作提供技术支持。     

Genetic structure of Xiphinema pachtaicum and X. index populations based on mitochondrial DNA variation

The dagger nematodes Xiphinema pachtaicum and X. index are two of the most widespread and frequently occurring Xiphinema spp. co-infesting vineyards and other crops and natural habitats worldwide. Sexual reproduction is rare in these species. The primary objective of this study was to determine the genetic structure of X. pachtaicum and X. index populations using eight and seven populations, respectively, from different "wine of denomination of origin (D.O.) zones" in Spain and Sardinia (Italy), by studying mitochondrial (cytochrome oxidase c subunit 1 or COI) and nuclear (D2-D3 expansion segments of 28S rDNA) markers. Both Xiphinema spp. showed low intraspecific divergence among COI sequences, ranging from 0.2% (1 base substitution) to 2.3% (10 substitutions) in X. pachtaicum and from 0.2% (1 base substitution) to 0.4% (2 substitutions) in X. index. Population genetic structure was strong for both species. Nevertheless, molecular differences among grapevine-growing areas were not significant, and intrapopulation diversity was very low. It is hypothesized that this genetic homogeneity in the nematode populations reflects their predominant parthenogenetic reproduction mode and low dispersal abilities. Our results also show that X. pachtaicum populations in Spain have possibly been established from two different populations of origin. Results also demonstrated that the two DNA regions studied are suitable diagnostic markers for X. index and X. pachtaicum.