矮牵牛pMA DS4基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR方法从矮牵牛(Petunia hybrida)中克隆了MADS盒基因pMADS4,进行了全序列测定.测序结果显示,所得到的基因与发表的序列同源率为100%.该基因长度为910 bp,含有一个开放阅读框,编码253个氨基酸残基组成的蛋白,具有典型的植物MADS盒基因的结构,该蛋白序列与玉米(Zea mays)ZAG3、麻竹(Dendrocalamus latiflorus)DIMADS18和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AGL6的同源性分别为64%、64%和61%,说明pMADS4是AGL6在矮牵牛中的同源基因,推测它们具有相似的功能,都促进开花并且调节花器官形成.进化树分析显示,AP1/AGL9亚家族分为SEP、AGL6和AP1三个分枝,且AGL6分枝又进一步分为三组,分别与裸子植物、单子叶植物和双子叶植物类群相对应,预测通过分离植物的AGL6同源基因可以准确的判断植物所属类群.通过蛋白预测说明pMADS4蛋白以同源或异源二聚体的形式存在,具有结合DNA的功能.     

花生NBS-LRR类基因P9的克隆与序列分析

为探索花生NBS-LRR类基因在花生抗病中的分子作用机制,本研究以花生品种‘Z525’为试验材料,采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,克隆了花生叶片中的P9基因。结果表明,获得一个长度为3557 bp的序列,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF),ORF的长度为3195 bp(93 bp^3287 bp),编码1064个氨基酸(120.4 kD),等电点pI为5.92。序列分析表明,该基因编码的蛋白与花生中假定的抗性蛋白RPP13-like及花生二倍体野生种Arachis duranensis和Arachis ipaensis推测的抗病蛋白At3g14460、RPP13-like高度相似;P9蛋白属于NBS-LRR家族,具有典型的NB-ARC和LRR-3两个保守结构域,推测该基因参与花生抗病调控过程。蛋白质亚细胞定位预测表明该基因编码的蛋白主要位于叶绿体中,可能少量分布于细胞核中,推测该基因可能主要作为叶绿体蛋白参与细胞的抗氧化、抗衰老等抗逆过程,其次作为转录因子参与转录调控作用。本研究克隆了P9基因的全长cDNA序列,并对该基因序列、结构和功能等方面进行了分析,为进一步研究花生抗病分子机制提供理论基础,同时为花生抗病品种的选育提供理论支持。     

叶籽银杏GbMADS5基因的克隆与序列分析

MADS-box基因是一类编码转录因子的基因大家族,在植物的发育过程中具有重要作用。本研究采用RT-PCR技术从叶籽银杏（Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.）中克隆了MADS-box基因GbMADS5。序列分析表明,该基因编码区全长为666bp,含有一个完整的开放阅读框,编码221个氨基酸残基组成的蛋白质,具有典型的植物MADS-box基因结构,编码肽链包含了MADS区、I区、K区和C末端,但该基因不具有拟南芥（Arabidopsis thaliana）AG基因的N端区域。GbMADS5基因编码的蛋白序列与其它植物的MADS-box蛋白序列有着较高的一致性,与裸子植物（Gymnospermae）的AG基因相似性最高,其中与苏铁（Cycas revolute）的同源性高达91.07%。系统发育树分析显示,GbMADS5基因属于AG亚家族基因。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

钙影响花生胚胎发育/败育特异蛋白质的筛选与鉴定

缺钙花生（Arachis hypogaea L.）严重空荚（胚胎败育）导致减产降质长期困扰南方花生生产。以大田足（施足钙）、缺（缺钙地大田本底）钙条件下花生的种植与观察为基础 ,利用改良的传统双向电泳、MALDI-TOF质谱和蛋白质数据库等手段,得到了7个与受钙影响花生早期胚胎败育/发育有关的差异表达蛋白。4^#差异蛋白是与菠菜（Spinacia oleracea）的70 kD的叶绿体被膜休克相关蛋白高度相似的缺钙组表达上调的特异蛋白; 6^#差异蛋白与三叶胶（Hevea brasiliensis）的线粒体前体中的ATP合酶的β链高度相似,该蛋白在缺钙幼胚缺失; 7^#差异蛋白在低钙组缺失,其与马铃薯（Solanum tuberosum）的肌动蛋白97或100类似,等等。研究结果提示,受钙胁迫花生幼胚败育可能与早期幼胚内能量转化、氧化还原系统、细胞内膜以及细胞骨架功能维持相关的功能基因的表达异常有关。初步揭示了受钙影响花生胚胎败育的分子机理。     

花生Clp蛋白酶基因(AhClpP)的克隆与序列分析

Clp蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽,从而保证细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花14种子不同发育时期混合cDNA文库中发现一条序列,全长为1 212 bp,3′端含有polyA尾,通过blastx搜索得知其为Clp蛋白酶基因。该序列与GenBank中EZ736390.1的序列相似性达到99%。以该花生cDNA序列为模板设计引物,以花生幼嫩种子cDNA为模板克隆得到花生Clp蛋白酶基因。序列分析表明,AhClpP基因的开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸,预测其分子量为30.9 kDa,等电点为9.07,编码的蛋白包含S14-ClpP-2保守结构域,无信号肽,定位于线粒体。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对,发现与拟南芥、蓖麻的Clp蛋白酶同源性较高。花生AhClpP基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

不同花生基因型脂肪酸脱氢酶基因序列分析

根据Δ¹²-脂肪酸脱氢酶（FAD）保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR扩增,获得了花生属不同基因型的全长为1 140 bp的cDNA序列。序列分析结果表明,序列编码379个氨基酸的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为42 kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白（membrance-anchored protein）重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些分析表明所获得的序列为Δ¹²-脂肪酸脱氢酶。系统进化树分析表明,FAD序列在花生属植物进化过程中较为保守;与其他物种的FAD序列也具有较高的同源性。这为探讨花生属植物之间的进化关系提供了一定的分子水平证据。     

一个绿竹MADS-box基因的克隆与序列分析

MADS-box基因编码的转录因子在植物花器官发育过程中起着重要作用.采用RT-PCR技术,从绿竹(Bambusa oldhamii L.)中分离到一个MADS-box基因,命名为BOMADS1(GenBank登记号:EF517293).BOMADS1编码区cDNA全长723 bp;编码区共编码240个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,其编码肽链包含了MADS区、K区、Ⅰ区和C末端.序列分析结果表明,BOMADS1编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与石刁柏(Asparagus officinalis L.)的AOM3高达87%.系统进化树分析表明BOMADS1基因属于E类功能基因.     

一个与小麦雄性不育育性转换相关的MADS-box转录因子基因

为了揭示YS型小麦温敏雄性不育育性转换的基础, 构建了该类型不育系A3017的不育和可育幼穗正、反杂交的两个SSH-cDNA文库。经文库比较, 在不育文库中筛选出一个与MADS-box基因同源的EST序列(GenBank登录号: 36925702)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据, 设计引物对该基因在可育和不育幼穗中的表达进行了RT-PCR分析, 结果表明, 该基因在不育幼穗中表达量较高, 可育幼穗中表达量很低。对不育幼穗中扩增出的cDNA片段进行克隆测序, 获得了666 bp的cDNA序列。序列分析表明, 该片段编码160个氨基酸, 具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box, 被定名为TaMS-MADSbox, 与一个小麦MADS box转录因子基因WAG的氨基酸序列的相似性为94%。进一步以3种不同类型的小麦雄性不育系和保持系的幼穗cDNA为材料, 利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式分析发现也存在类似差异, 该基因在不育系幼穗中表达量较高, 而保持系幼穗中表达量较低。以上分析表明, 该MADS-box转录因子基因的表达与小麦雄性不育系的育性转化相关, 表达量高时表现雄性不育, 表达量低时表现雄性可育。     

红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因克隆及表达分析

为了研究红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方脂肪组织提取总 RNA，反转录获得 cDNA 模板，利用设计的引物 PCR 扩增获得 SREBP-1和 SREBP-2开放阅读框（ORF）， SREBP-1基因 ORF 区的 cDNA 序列长度为3330 bp，编码1109个氨基酸，SREBP-2基因 ORF 区的 cDNA 序列为3444 bp，编码1147个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测 SREBP-1基因在红鳍东方不同组织中的表达特征，结果表明， SREBP-1在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体 pET32a 上，利用 IPTG 对重组质粒 pET32a-SREBP-1在大肠杆菌 Rosetta（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳显示在141 kDa 处有特异性的条带出现。     

糯玉米的成熟胚培养

以糯玉米成熟胚为外植体作离体培养,研究在培养基中添加植物激素,硝酸银及有机物等对玉米愈伤组织的诱导和胚性愈伤继代生长的影响。结果表明：在诱导培养阶段,N6+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 2mg/L的培养基诱导率最高,愈伤质量好;在继代培养阶段,MS+6-BA 0.2mg/L+2,4-D 2mg/L +AgNO310mg/L或CW (Coconut Water) 10%的培养基可改善胚性愈伤的质量。     

麦胚营养酥性饼干的研制

对一种新型麦胚营养酥性饼干的配方及工艺进行了探讨,通过单因素及正交试验得出其最佳配方为:面粉与麦胚质量比为1∶5,糖20%,油32%;当饼干厚度约为4 mm,经6次辊压时得到最佳工艺效果。该饼干不仅含有多种人体必需氨基酸及维生素,营养价值高,而且还具有多种保健功能,加入麦胚还可以改善饼干的外观、质地和风味。     

春玉米胚的建成规律

采用三因素二次饱和Ｄ－最优设计方法，对不同密度、施氮量和播期的，春玉米胚的形态建成及脂肪含量变化研究结果表明，春玉米胚建成过程中，其鲜重、干重、体积均呈直线递增变化，递增幅度以鲜重＞体积＞＞干重；而含水率则呈直线下降趋势。密度增加、施氮量增大或期延迟，均使胚的鲜重、干重、体积有不同程度的下降，含水率则有不同程度的增加。胚中脂肪含量总的变化趋势呈单峰曲线，峰值出现在授粉后第３５天。随密度增加、施氮量     

波尔山羊胚胎克隆的研究

以波尔山羊早期胚胎卵裂球作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同发育阶段胚胎的卵裂球对核移植重构胚的融合率的影响,研究Vero细胞对重构胚体外发育的影响,检测重构胚发育成为个体的能力。结果表明:以体内成熟和体外成熟卵母细胞做核移植受体,重组卵的融合率分别为85.7%和88.7%,二者之间差异不显著(P>0.05);以来源于8,16,32细胞阶段的卵裂球做核供体,重组卵的融合率分别为91.6%,86%,89.2%,三者之间差异不显著(P>0.05);融合后的重构胚与Vero细胞单层共培养,卵裂率65.5%和桑椹胚率32.7%均高于单纯TCM199培养的53.1%和10.6%(P<0.05);移植18枚融合后的重构胚于2只受体山羊输卵管,结果未获得妊娠;移植经体内培养得到的3枚桑椹胚于受体山羊子宫内,获得妊娠1只,总体的妊娠率为33%(1/3),怀孕的受体羊维持妊娠到期,产下1只母羔,初生重3.45 kg,一周岁时体重达到42.5 kg。通过自然交配产下一对波尔山羊羔。     

Embryo rescue in plants—a review

Summary The plant breeders usually rescue inherently weak, immature or hybrid embryos to prevent degeneration. The successful production of plants from the cultured embryos largely depends upon the maturation stage and the composition of the medium. Abortion of embryos at one or the other stage of development is a characteristic feature of distant hybridization. For the first time successful embryo culture to obtain an interspecific cross between Linum perenne × L. austriacum was demonstrated by Laibach (1925, 1929). Since then several refinements have been made in embryo culture/embryo rescue techniques which have been a popular approach for raising hybrids from a number of incompatible crosses. Currently embryo rescue holds great promise not only for effecting wide crosses, but also for obtaining plants from inherently weak embryos, obtaining haploid plants as well as for shortening the breeding cycle.     

Embryo rescue in Rosa hybrida L.

Summary Two crosses between Rosa hybrida L. cultivars, that fail to produce progenies by conventional means, were carried out. In one of them, total hip abscision occured seven weeks after pollination; in the other one, only 2% of the fertilized hips remained on the plants after eleven weeks. Four- and five-week-old fertilized ovules were isolated in the first cross and six-week-old embryos in the second. The ovules were cultured on six media which differed in their mineral salt and sucrose concentrations while the embryos were cultured on only one of these media and eventually cold treated for one month at 4° C before being placed in a culture room set at 23° C. The embryos that had been isolated in ovulo when they were still not visible under a binocular lens developed atypically. The embryos isolated in ovulo when they were heart-shaped and on average 0.27 mm long performed in ovulo germination on some media and/or enlargement on all of them after two weeks; after another two week culture, once isolated from the ovule, all of them germinated. The cultured isolated embryos, that were exposed to cold, enlarged and germinated more rapidly when placed at 23° C than those not exposed to cold. Furthermore, the plantlets resulting from untreated embryo germination were characterized by large cotyledons which were only partially green. These results are discussed in regard to embryogenesis, precocious germination and dormancy.     

鸭胚胎代用蛋壳培养的研究

采用两种方法进行了鸭胚胎代用蛋壳培养,旨在提高出雏率。方法Ⅰ将新鲜种蛋的胚胎转移至代用蛋壳Ⅰ内培养,72h后转移至代用蛋壳Ⅱ内培养至出雏。方法Ⅱ将正常孵化72h后的胚胎转移至代用蛋壳Ⅱ后培养至出雏。方法Ⅰ组出雏率为19.2%(10/52);方法Ⅱ组出雏率为40.4%(21/52)。从第6天到出雏同一日龄胚胎存活率方法Ⅰ组显著低于方法Ⅱ组和对照组(P<0.05或P<0.01)。第16天到出雏同一日龄胚胎存活率方法Ⅱ组显著低于对照组(P<0.01)。结果表明方法Ⅰ和方法Ⅱ两种方法均能获得雏鸭,方法Ⅱ优于方法Ⅰ。     

利用胚挽救获得葡萄三倍体植株

为获得三倍体葡萄新种质,以葡萄四倍体‘醉金香’×二倍体‘秋黑’杂交所得幼果为试材,研究了幼果低温处理天数、培养基IAA浓度、胚珠处理方式以及不同光质等因素对胚发育及胚萌发的影响。结果表明,采集授粉后35 d的杂交幼果,先进行4℃低温处理,再取出胚珠接种,有利于胚发育和萌发,以低温40 d和30 d处理的胚发育率和萌发率最高,分别为91.8%和24.4%;培养基IAA浓度为0.2 mg/L时可显著提高胚萌发率;进行切喙处理的胚珠胚萌发率显著高于完整胚珠接种;发光二极管LED复合光(红∶蓝∶白=3∶1∶1)比日光色荧光灯(日光灯)更适合杂种胚萌发;用流式细胞仪检测了20个杂种后代株系,其中三倍体株系19个,后代三倍体株率为95.0%。     

羊胚胎生物技术研究进展及应用

阐述了胚胎移植、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎性别控制及体外受精等胚胎生物技术在养羊业的研究进展及应用现状。     

玉米胚叶再生植株研究

玉米(Zea mays L.)组织培养早在70年代就已开始, 已有从花药、幼穗、幼胚等不同外植体获得再生植株的报道[1～5]. 然而用玉米胚叶诱导愈伤组织并再生出完整植株, 却未见报道. 以玉米胚叶作外植体诱导产生再生植株, 避免了以幼穗、幼胚等作外植体进行玉米组织培养及转基因研究时, 取材受生长季节限制的困难, 极大地方便了取材,