供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响

本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示：雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞（56.6% vs 39.5％,P﹤0.05）,但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组（54.5％ vs 78.2％,P﹤0.05）,但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。     

哺乳动物体细胞异种核移植胚胎早期发育的研究进展

体细胞异种核移植是指将一个物种的体细胞移植到另一物种的去核卵母细胞中,移入的体细胞核在受体胞质中重编程并发育成新个体的实验方法。该方法为拯救濒危物种和获取灵长类胚胎干细胞提供了可能的途径。但这方面的研究目前还只获得初步的进展,核重编程不完全以及异种胚胎的囊胚率低仍是其面临的主要难点。本文从基因表达、表观重编程、线粒体异质性、核重塑和核移植体系优化等方面入手,介绍近年来哺乳动物体细胞异种核移植的研究进展,并探讨异种重构胚重编程所面临的关键问题和可能获得成功的方法。     

天祝白牦牛Y染色体性别决定基因(SRY)编码区的克隆和原核表达

从天祝白牦牛(Bos grunneins)的基因组DNA中扩增了Y染色体性别决定基N(SRY)编码区序列,将其克隆至pGEM-T easy载体,天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp,编码229个氨基酸(GenBank:FJ373272);对牦牛和奶牛(B.grunneins)的SRY基因编码区进行序列比对,发现存在2个碱基的变异,造成1个氨基酸的变异;将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体,成功地构建了表达载体pET-28a/SRY;把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG在30℃ 200 r/min条件下诱导,获得了SRY蛋白的大量表达;对表达产物进行Western blot检测,结果显示获得的蛋白能与抗-His单抗特异性结合,确定了牦牛SRY蛋白的表达.     

猪核移植供体细胞的分离培养及传代的研究

通过对猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代的研究,摸索出一套猪体细胞的分离、培养和传代的方法,建立了猪的供体细胞系。研究结果表明:猪的卵丘细胞单层的生长需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞,组织块法单层的生长需要10~11 d,酶消化法需要8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些供体细胞培养方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞材料来源。     

供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响

本研究探讨供核细胞处理策略(新鲜消化、-196℃冻存组(复苏后)和曲古抑菌素(TSA)处理组)和TSA-CR1aa胚胎培养液处理时间对克隆胚发育的影响。利用体细胞核移植技术生产奶牛克隆胚胎,将部分克隆胚移植给自然发情同步的受体,检验克隆胚的体内发育能力。结果显示:TSA处理体细胞组的克隆胚卵裂率和囊胚率与新鲜消化和-196℃冻存组相比差异显著(P<0.05);-196℃冻存组与新鲜消化组差异不显著;用TSA-CR1aa分别处理新鲜消化细胞构建的克隆胚0、24、48和60h,其中,60h处理组的囊胚率最高(36.11±1.78%)与其他组对比差异显著(P<0.05);用TSA-CR1aa分别处理TSA处理组构建的重构胚24、48和60h,结果发现,60hTSA-CR1aa处理组囊胚率(37.39±1.78%)最高,显著高于24h(25.48±1.34%)TSA-CR1aa处理组,且差异显著(P<0.05)。将所获得的克隆胚胎分别移植给40头自然发情的受体母牛,并观察移植25,45,65和90d后的返情情况,结果显示,各组受孕率无统计学差异,但经TSA处理细胞和胚胎组移植的受体中,获得一头存活的体细胞克隆奶牛。说...     

哺乳动物体细胞克隆存在的问题及其思考

摘要：动物克隆理论和技术研究的深入和范围的扩大,以克隆技术为平台的研究与应用已经引起了世人的关注。着重对供体细胞核和受体细胞质周期同步化、克隆动物早衰、发育缺陷以及供体细胞传代问题进行了分析和探讨,阐述了各种哺乳动物克隆研究现状,同时对人们关心的动物克隆问题提出几点思考意见。     

牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅲ基因cDNA 3'末端全长的克隆与序列分析

分别利用基因特异引物YMT-ⅠSP、YMT-ⅢSP和M13引物M4,通过RT-PCR和3'-RACE方法从牦牛(Bos grunniens)肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛Metallothionein-I(MT-I)和Metallothionein-Ⅲ(MT-Ⅲ)cDNA 3'末端全长序列(分别为331和378 bp,GenBank登录MT-Ⅰ No.AY758557,MT-Ⅲ No.DQ492300),其中分别包含MT-Ⅰ基因编码区全长(183 bp)、MT-Ⅲ基因编码区全长(207 bp),同时在MT-Ⅰ和MT-Ⅲ基因cDNA的3'末端具有加尾信号AATAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly(A).分析表明,牦牛MT-Ⅰ基因编码的MT-Ⅰ蛋白由61个氨基酸组成,其中20个半胱氨酸(Cys)具有保守的三肽结构:C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C等,在分子进化上十分保守;MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成,其中19个Cys除了具有与MT-Ⅰ以上相同的保守短肽结构外,牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构,在分子进化上亦很保守.这些结构决定了MT-Ⅲ既具有与MT-Ⅰ相同的重金属解毒等生理功能,又具有区别于MT-Ⅰ的抑制神经元生长的特异功能.     

世界首例成活的体细胞克隆水牛在广西大学诞生

2005年3月17日凌晨4时15分，一头体细胞克隆水牛在广西大学平安诞生。它不仅是世界首例成活的体细胞克隆水牛，也是世界首例成年体细胞克隆水牛。     

牦牛MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA3’末端全长的克隆与序列分析

分别利用基因特异引物YMr-ISP、Ymr-ⅢSP和M13引物M4，通过RT-PCR和3＇-RACE方法从牦牛（Bos grunniens）肝脏和大脑组织RNA中分别扩增并克隆出了牦牛Metallothionein-I（MT-I）和Metallothionein-Ⅲ（MT-Ⅲ）cDNA3’末端全长序列（分别为331和378bp，GenBank登录MT-I No．AY758557，MT-Ⅲ No．DQ492300），其中分别包含MT-I，基因编码区全长（183bp）、MT-Ⅲ基因编码区全长（207bp），同时在MT-I和MT-Ⅲ基因cDNA的3’末端具有加尾信号从TAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。分析表明，牦牛MT-I基因编码的MT-I蛋白由61个氨基酸组成，其中20个半胱氨酸（cys）具有保守的三肽结构：C-X-C、C-C-X-C-C、C-X-X-C等，在分子进化上十分保守；MT-Ⅲ编码的蛋白质由68个氨基酸组成，其中19个Cys除了具有与MT-I以上相同的保守短肽结构外，牦牛MT-Ⅲ蛋白质的氨基酸序列还具有T、CPCP、GEGAEA等MT-Ⅲ蛋白质特异的保守短肽结构，在分子进化上亦很保守。这些结构决定了MT-Ⅲ既具有与MT-I相同的重金属解毒等生理功能，又具有区别于MT-I的抑制神经元生长的特异功能。     

不同品种、外植体和光照条件对花生体细胞胚诱导的影响

用11个不同花生品种的胚轴为外植体，接种于含2，4－D的MS培养基进行体细胞胚的诱导。结果表明，不同的花生品种对花生体细胞胚的诱张每个外植体产生的体细胞胚的数目影响很大。此外还对不同外植体来源及不同的光照条件对花生体细胞胚诱导进行了研究。结果认为，成熟胚轴最适合于体细胞胚的诱志；不同品种最适合体细胞胚产生的光照条件不一样，汕油71要求在黑暗的条件下培养，泉花10号则要求有一定的光／暗比。     

黑麂耳成纤维细胞培养及异种重构胚构建

黑麂(Muntiacus crinifrons)是我国特有的珍稀濒危物种。采用组织块贴壁法获得了纯化的黑麂耳成纤维细胞。用3种不同的培养液(DMEM(低糖)、DMEM(高糖)和RPMI-1640)对第3代细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间相近,DMEM(低糖)的培养效果稍好。以黑麂耳成纤维细胞为核供体,以山羊和兔卵母细胞为胞质受体,通过核移植构建异种克隆胚,囊胚率分别为0和11.5%,结果表明两种胞质受体均能支持黑麂耳成纤维细胞核的重编程,但重构胚的发育能力有所差别。     

猪体细胞克隆技术的优化

摘要: 用体细胞核移植方法生产的克隆猪诞生至今已经8年,虽然同胚胎细胞核移植相比,体细胞核移植技术难度大,成功率低（1~2%）,但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了较深入的研究,在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。本文结合本实验室近年来的相关研究工作,综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

体细胞核移植技术在猪基因修饰中的应用

基因修饰猪作为一种理想的动物模型已应用于生物医学研究。构建基因修饰猪的方法很多,包括原核注射、慢病毒转染、精子介导和体细胞核移植等,其中体细胞核移植具有显著优势,一直是构建基因修饰猪的重要方法。近几年,随着转座子、设计核酸酶等基因修饰新技术以及诱导性多能干细胞研究的不断进展,将进一步凸显体细胞核移植技术在基因修饰猪构建中的价值。本文比较了猪基因修饰的主要方法,并论述体细胞核移植技术在猪基因修饰中的优势、发展历程和最新应用等。     

黄牛和水牛种间核移植研究初报

本实验探讨了将体外培养成熟的水牛卵母细胞去核后 ,作为体外受精生产的黄牛胚胎细胞核移植的受体进行种间核移植的可能性。结果表明 ,黄牛与水牛进行种间核移植的重组卵有 54.2 %的融合率 ,显著地低于黄牛种内核移植的结果 ( 75.0 % ,P<0 .0 5) ;而卵裂率两者之间差别不大 (分别为 65.4 %和 71 .2 % ,P>0 .0 5)。但来自种间核移植的早期胚胎体外发育潜能很低 ,体外囊胚发育率只有 5.9% ,很显著地低于种内核移植的结果 ( 50 .0 % ,P<0 .0 1 )。用作种间核移植受体的体外成熟水牛卵母细胞质量较差可能是造成重组胚体外发育能力低的主要因素之一。     

亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A对东北野猪核移植胚发育的影响

体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。     

微生物直接种间电子传递:机制及应用

微生物种间电子传递(Interspecies electron transfer,IET)是指电子供体微生物与电子受体微生物之间通过直接或间接方式传递电子形成互营生长关系,从而共同完成单一微生物不能完成的代谢过程的现象。IET分为间接种间电子传递(MediatedIET,MIET)和直接种间电子传递(Direct IET,DIET)。其中,前者一般需要氢、甲酸、核黄素等作为电子载体,而后者是指微生物间通过纳米导线、氧化还原蛋白、导电颗粒等进行直接电子交换。DIET是最新发现的IET方式,DIET的发现改变了微生物互营代谢必须依赖氢/甲酸等能量载体的传统认识。本文在论述MIET的同时,重点阐述了DIET的三种介导机制,列举了参与IET的典型微生物种类,系统介绍了IET在厌氧消化产甲烷、甲烷厌氧氧化、微生物脱氯等重要环境过程中的作用机制及应用潜力,并展望了微生物种间电子传递的未来研究方向。本综述有助于加深对微生物IET发生机制的认识,为理解微生物IET在自然界碳氮等元素循环、温室气体排放、污染物降解等关键生物地球化学过程中的作用提供理论基础,为IET的实际工程应用提供可能。     

点压去核法对猪体细胞核移胚发育影响

卵母细胞的去核是细胞核移植过程中的关键环节。在核移植研究中，卵母细胞的去核程度与重组胚再程序化的状态密切相关，去核效率高，其克隆胚胎最终发育成正常个体的可能性越大。去核步骤仍是胚胎克隆技术中最耗时间的步骤之一。本研究比较了三种去核方法。     

牛体细胞核移植胚和孤雌激活胚的两步法体外培养

摘要：研究了牛体细胞核移植胚和孤雌胚在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示：牛孤雌胚在培养液BECMaa＋10％FBS中的囊胚发育率明显高于SOFaa＋10％FBS或TCM199＋10％FBS （16.5% ∶ 13.6% / 12.8%, P＜0.05）；而在SOFaa＋10％FBS中添加还原型谷胱甘肽（GSH）后，牛孤雌囊胚的发育率显著提高（18.5% ∶12.8%, P＜0.01）。成纤维细胞生长因子4（FGF4）或胰岛素添加进无血清SOFaa（含GSH）中，可明显提高牛体细胞核移植胚的囊胚发育率（8.7% / 9.3%∶5.5%, P＜0.05），血清存在时，这两种生长因子无明显作用。依据上述结果及牛早期胚胎的代谢特征，以SOF为基础液合成两组培养液分两步培养牛胚胎，即先用胚胎培养液Ⅰ（SOFnaa＋GSH＋EDTA＋insulin）培养72 h，然后换用胚胎培养液Ⅱ（SOFaa＋GSH＋5％FBS＋葡萄糖＋insulin）继续培养，与对照组（SOFaa＋GSH＋10％FBS一步培养）相比，牛孤雌胚和核移植胚的囊胚发育率都明显提高（22.3%∶18.5%; 15.0%∶11.7%, P＜0.01），说明两步法培养体系更符合牛早期胚胎不同发育阶段的代谢特征和营养需求，是一种适宜的牛胚胎培养方法。