天山雪莲遗传转化体系建立

采用根癌农杆菌介导法进行GFP基因的遗传转化,建立了农杆菌介导天山雪莲遗传转化体系。以天山雪莲胚性愈伤组织为受体;40 mg/L的卡那霉素为胚性愈伤组织筛选质量浓度;胚性愈伤组织预培养2 d后用含100μmol/L AS和500 mg/L脯氨酸的感染工程菌液侵染25 min,能够取得比较理想的转化效果。对8株卡那霉素抗性植株进行PCR及GFP荧光蛋白检测,共获得6株阳性植株。结果表明GFP基因已整合到天山雪莲的基因组中并得到表达。     

天山雪莲组织培养体系的优化

通过研究天山雪莲种子消毒萌发条件、愈伤组织培养和继代培养条件,优化出了一套能获得总黄酮成分含量较高的天山雪莲愈伤组织的组织培养体系。结果表明:将种子用70%乙醇处理30 s、0.1%升汞溶液处理10 min,并种植于MS培养基,可获得生长状态良好的雪莲苗。比较了7种培养基对天山雪莲无菌苗叶片愈伤组织的诱导情况,愈伤诱导率均能达到100%,其中4种培养基获得愈伤组织适合继代培养。在继代培养中,①号培养基的愈伤组织易分化出根,②号培养基、③号培养基的愈伤组织易分化出芽;④号培养基可得到较多黄绿色致密愈伤组织。对①号、②号、③号、④号培养基获得愈伤组织的总黄酮含量检测,发现其总黄酮含量为1.14%～7.37%,远高于《中华人民共和国药典(2015版)》不少于0.15%的规定,以②号培养基的愈伤组织总黄酮含量最高。     

天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。     

天山雪莲的研究进展

天山雪莲是维吾尔民族特色药用植物,因其药用价值很高而具有广阔的市场前景.从生药学、化学成分、药理作用及资源方面.对其研究进展进行综述.以期为更好地保护、利用和开发这一特色资源提供依据.     

PmACRE基因的克隆及遗传转化拟南芥

Avr9/Cf-9 rapidly elicited(ACRE)gene是富含亮氨酸重复单元,参与蛋白与蛋白互作,特异性识别病原物激发子的关键基因,在植物抗病过程中有重要意义。利用RT-PCR从马尾松中克隆出Avr9/Cf-9 rapidly elicited gene,命名为PmACRE(Gen Bank登录号:MF630966)。测序结果显示,PmACRE c DNA序列全长862 bp,其中完整编码区长度624 bp,编码207个氨基酸;以PFGFP Bar 137质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动PmACRE基因的植物表达载体PFGFP Bar 137-PmACRE;采用冻融法转入农杆菌AGL1菌株,通过花序浸染法对拟南芥进行了遗传转化,并获得了4株阳性苗,经目的基因ACRE和GFP基因双重PCR检测,证实目的基因已整合到拟南芥基因组中。研究结果为进一步分析马尾松ACRE基因的功能和深入揭示R基因调控马尾松响应松材线虫侵染的作用机制奠定基础。     

天山雪莲SikFBP1基因的抗寒性研究

在植物体内,FBPase酶是卡尔文循环内一个不可缺少的酶,在干旱、高温、盐碱等非生物胁迫中FBPase同样起着重要的作用。本试验从典型的耐极端低温的植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.ER Kir.)中克隆了一段FBPase序列,命名为SikFBP1,同时也克隆出了一段SBPase序列命名为SikSBP。实时荧光定量显示2个基因对寒冷胁迫都做出了响应,为验证其抗寒性功能分别转入了烟草中。通过RT-PCR验证获得转化植株,低温胁迫下,通过丙二醛(MDA)含量、相对电子渗透率(REL)、过超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)及光合效率(Pn)的测量,发现转SikFBP1基因株系与转SikSBP基因株系在光合效率上提高较为微弱,但在耐寒性方面得到了一定的提高,为FBPase的功能研究提供一定参考。     

陆地棉GhDGAT1基因干涉载体构建与遗传转化

二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是生物体内三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究克隆陆地棉GhDGAT1基因308bp片段,构建了该基因含内含子结构的hpRNA干涉载体;应用花粉管通道法转化棉花,研究内源基因GhDGAT1沉默对棉花油分含量的影响。结果表明:1)经PCR及Southern杂交鉴定,转基因种子中GhDGAT1基因表达量受到显著抑制,种仁含油量下降,最多下降3.13%。2)种子油脂量显著减少的株系中,总蛋白含量及可溶性糖分含量,分别相对提高4.31%～9.77%和11.67%～23.01%。3)与野生型相比,转基因株系幼胚在发育后期鲜重降低,而可溶性蛋白含量升高。4)与对照相比,转基因植株的株高、第一果枝高度、果枝数均显著降低,但其他农艺性状与主要的经济性状均未受到显著影响。研究表明,通过调控GhDGAT1基因的表达可影响陆地棉的油脂合成,调节棉籽油分含量。     

玉米ZmSKIP基因的克隆转化

随着淡水资源的匮乏,干旱已成为影响玉米产量众多因素中最主要的非生物因素。而植物的耐旱性又属于数量遗传性状,这给广大遗传育种工作者带来了一个很大的难题。SKIP基因属于RNA调控基因,它参与调节生物体内多种RNA的剪切调控,进一步调整植物状态,应对逆境环境。利用BLAST搜索玉米基因组,得到相似度99%的玉米基因,命名为ZmSKIP。对该基因克隆和生物信息学分析,构建过量表达载体,使用原位转化法得到过表达该基因的转基因株。对转基因株进行耐旱性实验,并使用ELISA方法检测转基因株的ABA含量。结果显示,转基因株中ABA相对野生型上升明显,具有更高的耐旱性。初步推断ZmSKIP在玉米中可能调控相应的耐旱基因表达从而调节植物对逆境的适应能力。     

天山雪莲根尖染色体制片影响因素研究及组型分析

对天山雪莲的根尖进行染色体常规压片,旨在为其系统分类、遗传育种及分子生物学研究提供依据。分析不同取材时间、预处理和酸解时间对天山雪莲染色体制片的影响,每处理随机挑选1 000根尖细胞进行观察,比较中期细胞和适宜核型分析的中期细胞所占比例。结果表明,10:00取样,用0.002 mol/L 8 羟基喹啉与1 g/L秋水仙素按等体积混合0 ℃预处理24 h,1 mol/L盐酸58 ℃解离7 min制片所得染色体分散效果最佳。核型公式为2 n=2 N=20 m+16 sm,染色体相对长度组成为2 n=32=8 L+6 M2+6 M1+12 S,核型不对称系数(As.k)为60.998 %,属于2B类型,核型对称性程度高,说明天山雪莲在进化中处于趋向于原始类型。     

天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建

以天山雪莲(Saussurea involucrataKar.et Kir)幼嫩叶片为研究材料,利用CreatorTMSMARTTMcD-NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cfu/mL,文库插入片段多在1 000 bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。     

新疆雪莲多倍体的诱导初探

用秋水仙素和2%二甲基亚砜共同处理新疆雪莲种子、胚根和茎段,以诱导多倍体雪莲.结果表明,茎段经过100 mg·L-1秋水仙素处理3 d诱导效果最佳,同时,离体培养其嵌合体苗茎段及叶片,诱导不定芽生成,获得了四倍体细胞比例达到90%以上的植株.     

植物激素和活性炭对新疆雪莲组培苗生根的影响

研究了不同植物激素和活性炭对新疆雪莲组培苗生根的影响,测定了根长、根粗、根数和生根率4个生根指标,结果表明:添加生长素IAA、IBA和NAA均可以不同程度地促进生根,但0.2mg/L的IAA效果最佳,根长最长达5.5mm,根粗最小0.96mm,根数最多达9.75条,生根率达100%;添加活性炭可以提高生根质量,最适添加量为1mg/mL。此时,根长最长达25.51mm,根粗最小为0.6mm,根数最多达13条,生根效果最佳。     

藏雪莲水提取物对小白鼠组织中一氧化氮含量的影响

[目的]研究藏雪莲水提取物对小白鼠组织中一氧化氮含量的影响,为藏雪莲抗缺氧机制的研究提供参考。[方法]将100只小白鼠随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组,连续24 d分别灌服不同剂量的藏雪莲水提取物和生理盐水,然后处死小白鼠快速采取肝、肺、心肌和骨骼肌,测定各组织内一氧化氮的含量。[结果]结果表明,高剂量组的肝、肺和骨骼肌和中剂量组的肝中一氧化氮含量中显著高于对照组和低剂量组,差异极显著(P<0.01);中剂量组的肺和骨骼肌中一氧化氮含量高于对照和低剂量组,差异显著(P<0.05);对照组的心肌中一氧化氮含量高于各药物组,差异极显著(P<0.01)。[结论]藏雪莲能够提高小白鼠肝、肺和骨骼肌中一氧化氮的含量,降低心肌中的含量。     

新疆天山雪莲组培快繁技术的建立

[目的]探讨新疆天山雪莲组培快繁技术。[方法]以新疆雪莲切除根部的无菌苗,或无菌苗的真叶,或者直接采集野生的新疆雪莲幼嫩部位作外植体,进行愈伤组织诱导培养及丛生芽分化、丛生芽增殖继代培养、生根培养和组培苗移栽试验。[结果]新疆天山雪莲外植体在MS+NAA 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L和MS+6-BA 1.0+NAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培养基上可诱导产生大量的丛生芽;在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L培养基上交替培养,丛生芽继代快速增殖率达1.0∶3.5;组培苗在MS+NAA 0.2 mg/L培养基上诱导生根,生根率达83%;生根的雪莲组培苗经炼苗和移栽后成活,生长健壮。[结论]该研究建立的快繁技术为雪莲野生资源保护和产业化发展开拓了一条有效途径。     

新疆雪莲组织培养体系的优化

以新疆雪莲无菌苗的根、茎、叶为外植体,对各种不同激素配比条件下新疆雪莲的再生体系进行了探讨,结果表明:培养基MS+6-BA 0.1 mg/L + NAA 2.0 mg/L对愈伤组织诱导效果较好;而再生芽的诱导培养基为MS+6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.05 mg/L+水解乳蛋白500 mg/L;生根培养基为1/4MS + NAA 0.3 mg/L.     

新疆雪莲全长cDNA文库构建及表达序列标签(ESTs)特性分析

以野生新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kit)为研究材料,利用Creator SMARTTM cDNA Library Construction技术构建了雪莲全长cDNA文库,从野生雪莲中提取总RNA和mRNA , 用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链.通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA .将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上, 并对噬菌体进行包装,建成cDNA的全长库.经大肠杆菌XL1-Blue平板检测,原始文库滴度达4.03×107(pfu/mL).随机挑选500个克隆进行序列测定,PCR鉴定结果显示多数插入片段均在500 bp以上.将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,共有56个序列为非冗余数据.其中有14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,42个片段与已报道的基因有较高的同源性.这些EST数据为进一步筛选和克隆雪莲特异性表达基因提供了材料平台,为雪莲基因组数据增补了大量信息.     

新疆天山雪莲根部冻土产酶微生物的初步研究

利用不同培养基对新疆天山雪莲根部冻土微生物进行了分离与培养,通过16S或18SrDNA序列扩增初步鉴定了分离所得微生物,并构建系统发育树。结合选择性培养基进行了产蛋白酶、产甘露聚糖酶、产木聚糖酶、产纤维素酶和产淀粉酶等微生物的筛选。结果表明,新疆天山雪莲根部冻土中蕴含着丰富的产酶微生物,分离得到的34株细菌中大部分都能产酶,其中以产淀粉酶为主,部分产纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶。产淀粉酶细菌主要属于Pseudeomonas,Flavobacterium和Arthrobacter等属,产纤维素酶细菌主要属于Pseudeomonas和Arthrobacter等属。分离得到的5株真菌,以产淀粉酶和木聚糖酶为主。     

雪莲PEBP基因原核表达载体的构建及表达

根据雪莲PEBP基因序列设计特异性引物,利用实验室构建的Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,与表达载体pET-30a(+)连接转化BL21(DE3), PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,测序分析.经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明:PEBP得到大量表达,表达量占菌体总蛋白的26.8;,融合蛋白的相对分子量大约是28KD,与理论值相符,为进一步研究该蛋白的理化性质奠定了基础.