香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

笔者所在课题组从巴西香蕉中分离到1个PPO基因全长,并进行了原核表达,但结果未表达出目的蛋白。鉴于上述情况,笔者对香蕉PPO全蛋白进行转移肽分析,结果发现其N端含有转移肽,长度为47个氨基酸。切除转移肽并进行香蕉PPO成熟蛋白原核表达,SDS-PAGE电泳检测结果表明,在62 ku处有一条特异的蛋白条带,与预测大小相符;并且进行质谱分析,结果确定重组表达蛋白为香蕉PPO,初步说明转移肽对香蕉PPO体外表达的影响,为进一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐变生理和调控机制中的作用提供理论基础。     

小桐子转录因子JcZAT10基因的分离与低温表达分析

利用RT-PCR技术克隆小桐子C2H2型锌指蛋白ZAT10转录因子基因c DNA序列,命名为Jc ZAT10,并对其基因结构、功能结构域、系统进化及差异表达进行了分析。结果表明,小桐子Jc ZAT10基因开放阅读框全长753bp,编码250个氨基酸,推测蛋白分子量为26.7k Da,理论等电点为8.45,并鉴定到两个锌指结构域、核定位信号序列以及富Leu保守基序。系统进化分析显示,Jc ZAT10与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近,序列一致性为79.6%。qRT-PCR分析表明,小桐子Jc ZAT10基因存在组织表达特异性,在茎中表达量较高,而在叶片中表达量较低,但在叶片与根中受低温诱导表达,且都在低温胁迫3h时达到最大表达量。本研究为进一步对Jc ZAT10基因进行功能验证以及其在低温信号转导中的机制研究提供了依据。     

花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建

钙离子是细胞信号传导中重要的第二信使。CAX interacting protein(CXIP)是一类能够激活Cation exchanger(CAX)的钙离子转运活性蛋白,在离子转运体系中起重要作用。本研究利用RACE方法获得花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因的cDNA和DNA全长序列。该基因cDNA序列的全长包括966bp的开放阅读框,编码321个氨基酸。DNA全长为966bp,不含有内含子序列。推测的蛋白质分子量为36706.24Da,等电点为9.62。使用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了该基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了该基因的过表达载体、反义表达载体以及原核表达载体,为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用奠定基础。     

苎麻BnNRT1.1基因的克隆及表达特性研究

硝酸盐转运蛋白1.1(nitrate transporter 1.1,NRT1.1)在植物对硝酸盐的吸收与利用过程中具有非常重要的作用,明确其对苎麻的作用机制,可有助于提高苎麻的氮素利用率。研究通过克隆得到苎麻Bn NRT1.1基因的全长c DNA序列,共1869 bp,其中开放阅读框(ORF)1776 bp,编码591个氨基酸。生物信息学分析结果表明,苎麻Bn NRT1.1基因编码的蛋白质分子量为65.25 k D,等电点为8.85,为疏水性蛋白,具有12个跨膜结构域和15个磷酸化位点,在信号转导与氮素转运等代谢途径中具有重要功能。系统进化分析表明苎麻Bn NRT1.1基因与樱桃、白梨、桑树等NRT1基因具有同源关系。组织特异性表达分析发现,Bn NRT1.1主要在苎麻根中表达,而在茎、叶中的表达量相对较低;硝酸盐诱导处理发现,Bn NRT1.1在苎麻氮高效品种龙潭大麻中的表达量高于氮低效品种青皮杆麻,并且诱导处理3 d后不同品种中Bn NRT1.1表达量均达到最大值。该研究结果为苎麻对硝酸盐的吸收、转运和调控提供了分子生物学基础,旨在提高苎麻的氮素利用率。     

橡胶树铜转运蛋白基因的克隆及在健康树与死皮树中的差异表达

铜转运蛋白(Copper transporter,COPT)属于CTR/COPT铜转运家族,参与调节生物体内铜的动态平衡。根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbCOPT5基因的全长cDNA序列,其ORF长420 bp,共编码139个氨基酸,预测HbCOPT5蛋白分子量为15.67 ku,等电点为5.26,含有3个跨膜区。进化树分析结果表明,HbCOPT5与蓖麻、杨树中的COPT蛋白亲缘关系最近;在拟南芥的6个COPT蛋白中,与AtCOPT5的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,健康植株中HbCOPT5的表达量是死皮树中的2.8倍。     

巴西橡胶树HbRD22基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术从低温诱导的巴西橡胶树全长cDNA文库中获得了HbRD22基因,该基因全长1 458 bp。生物信息学分析结果表明,HbRD22编码一个由338个氨基酸组成的、相对分子量为36.96 ku、等电点为7.65的多肽,并含有一个由217个氨基酸组成的BURP结构域。其推导的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达69%。信号肽预测结果表明HbRD22蛋白为分泌型蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽区域。Northern blotting分析结果表明,该基因在正常生长情况下,表达水平较高,干旱胁迫后24 h,表达量逐渐减低,直至检测不到,揭示该基因受干旱胁迫负调控。     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子CsPPT2基因的克隆和分析

以茶树(Camellia sinensis)白叶1号为材料,应用RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族一个基因CsPPT2的c DNA序列,并与茶树体内另一个磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族的基因CsPPT1在不同时期和不同部位的表达进行比较。CsPPT2的c DNA全长1 469 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 218 bp,编码406个氨基酸。通过生物学信息分析表明,CSPPT2蛋白分子量为44.6 k D,理论等电点为9.90,CsPPT2有6个跨膜区,属于疏水性叶绿体跨膜蛋白。聚类分析显示,茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子家族分为2个亚组,而CsPPT1与CsPPT2属于不同亚组。荧光定量结果分析表明,两个基因可能在茶树体内功能不同,CsPPT2在所考察的组织中均有表达,且在根和成熟叶片中表达量远大于CsPPT1;CsPPT1在茎和复绿前的幼嫩芽叶中表达量高于CsPPT2。在白化期起始时CsPPT2有短暂的升高,但伴随白化受到较大的抑制,表明CsPPT2的表达抑制可能是白叶1号低儿茶素高氨基酸品质形成的关键因素。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

甘薯多酚氧化酶保守区的cDNA克隆及序列分析

多酚氧化酶是植物体内广泛存在的铜结合酶,催化一元酚或多元酚氧化生成“黑色素”,是引起果蔬等农产品褐变的主要原因。通过对已克隆的植物多酚氧化酶基因的分析,设计了一对简并引物,ＰＣＲ扩增了甘薯多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ,序列分析结果表明,该ｃＤＮＡ含有５９１个核苷酸,编码１９７个氨基酸,与已发表的其它植物的多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ具有很高的同源性。     

小麦籽粒PPO同工酶及其活性分析

为探讨小麦籽粒PPO同工酶与其活性的关系,以PPO活性差异较大的小麦品种为材料,分别检测了不同发育时期的籽粒、成熟籽粒以及浸润籽粒的PPO同工酶谱带及其活性.结果表明:花后10～20d,小麦籽粒PPO同工酶在高、低PPO活性品种间差异不明显.而花后20～30 d,高PPO活性小麦品种的中、低分子量PPO同工酶谱带明显强于低PPO活性品种.总体来说,PPO同工酶谱带强度随着籽粒成熟而降低,而PPO活性在花后30 d达到最大值.在成熟籽粒中,PPO同工酶的强弱与其活性的高低有着较好的一致性.随着籽粒的萌动,其PPO同工酶谱带逐渐增强,尔后降低;PPO活性亦有类似变化.与低PPO活性小麦品种相比,高PPO活性品种在浸润期间有着较强的同工酶谱带和较高的PPO活性.     

茶叶多酚氧化酶的序列分析与结构预测

调用生物信息学方法对已在国际互联网上的生物数据库(DDBJ、Uni-Prot)注册的茶树多酚氧化酶基因的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构进行预测与推断。结果表明:茶多酚氧化酶不具有信号肽,存在卷曲螺旋,为位于细胞质中的无跨膜的亲水性不稳定蛋白,无规则卷曲是其蛋白质结构的主要结构元件,α-螺旋与β-折叠分散于整个多肽链中,并存在2个结构功能域。     

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S:: BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol.L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55 mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

小麦多酚氧化酶研究进展

综述了小麦多酚氧化酶(PPO)的测定方法、生理功能、酶学特性和基因及其表达。PPO主要位于小麦种(果)皮中,是一类铜结合酶,其活性中心为铜结合区(CuA和CuB),不同植物PPO的铜结合区的氨基酸序列同源性较高。PPO由核基因编码,受多基因控制,有多种同工酶。PPO是导致面制食品的酶促褐变的主要原因,与小麦的抗病性密切相关。     

油莎豆5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因CeEPSPS的克隆与分析

起源于非洲和地中海沿岸的油莎豆以适应性广、产油量高而成为我国的新型油料作物。为促进该物种的开发与利用，研究基于基因组和转录组数据对油莎豆及代表性单子叶植物的EPSPS基因进行系统鉴定。结果表明：与大多数植物类似，油莎豆仅含有1个EPSPS基因，其包含7个内含子，命名为CeEPSPS;RT-PCR分离到的CeEPSPS编码区序列为1584 bp，预测编码514个氨基酸，其N端的前70个残基为叶绿体信号肽，77～508位残基为高度保守的EPSP合酶结构域（PF00275）；与EPSP合酶结构域相比，信号肽在不同植物中变异较大；CeEPSPS成熟蛋白的理论分子量为47.32 kDa，等电点为5.49，总平均疏水指数为0.069，脂肪族指数为93.76，不稳定系数为31.73，与其他物种相近，均属于稳定的疏水型酸性蛋白；进化分析支持油莎豆划归为禾本目莎草科。序列比对和基因组测序分析结果显示，56份油莎豆种质不存在已报道的草甘膦抗性变异。qRT-PCR分析结果显示，CeEPSPS主要在成熟叶片和块茎中表达，其表达水平显著高于芽、幼嫩叶片、衰老叶片和芽茎。此外，本研究还构建了CeEPSPS的植物过...     

茶树多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

茶树多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）对茶产品的品质形成具有重要作用,一直是人们研究的重点,但至今未见体外表达茶树PPO的报道。笔者在原核中表达纯化获得具有催化活性宜红早PPO的基础上,成功表达纯化获得切除转移肽的宜红早PPO成熟蛋白,该蛋白的比活力比全蛋白高约3倍,并发现转移肽对PPO活性具有抑制作用,这为茶树高活性PPO工程蛋白在体外大量制备及应用提供了基础。