茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12βh显著诱导了CsANR基因的相对表达水平,且在为害后3βh和12βh达到了极显著差异。CsLAR基因在茶尺蠖为害后6βh和12βh,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24βh显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48βh仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24βh和48βh均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。     

茶树肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及表达分析

肉桂酸4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因（CsC4H）的全长序列,其中开放阅读框长1β518βbp,编码505个氨基酸,推测蛋白分子量为58.15βkD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1β840βbp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体pYES-DEST52上,并在酿酒酵母WAT11中进行真核表达。利用LC-MS方法检测酶反应产物,结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。     

茶树CsbHLH2基因克隆及表达分析

植物bHLH（碱性螺旋环螺旋）转录因子是植物体内一类重要的转录因子,在植物的生长发育以及胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。本研究以茶树品种陕茶一号为材料,采用同源克隆法从陕茶一号叶片cDNA中克隆了1个bHLH转录因子CsbHLH2。生物信息学分析表明,CsbHLH2开放阅读框（ORF）为714βbp,编码1个297个氨基酸的蛋白,预测分子量58.4βkD,等电点为5.14,氨基酸序列比对显示该蛋白与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高同源性。拟南芥原生质体亚细胞定位表明,CsbHLH2编码蛋白定位在细胞核上。实时荧光定量PCR结果分析表明,CsbHLH2基因在茶树不同组织部位中均有表达,但是在幼叶中表达量最高;不同激素处理结果显示,CsbHLH2受SA、ETH、MEJA诱导。     

景宁白茶种质资源谪查与育种

白茶是我国稀有茶树品种,本文通过实地观测调查,并以种植在景宁的安吉白茶、迎霜、鸠坑品种为对照,对景宁白茶品种优良单株的形态特征、发育特性、品种种质进行了分析研究,并提出选育景宁白茶品种工作建议.     

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸（Vc）是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP cDNA全长序列,共计1510βbp,其中包含1β086βbp的开放阅读框（ORF）,编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599βkDa。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。     

铝诱导的茶树根系转录组变化分析

探讨茶树响应铝（Aluminum,Al）的基因调控网络和表达模式,确定一些关键候选基因,为茶树耐Al分子机制研究奠定基础。测定了0、0.2、1、2、4βmmol·L^-1 5个Al³⁺浓度处理7βd的福鼎大白茶根系抗氧化酶活性和Al含量变化,并提取0βmmol·L^-1（R0）、1βmmol·L^-1（R1）和4βmmol·L^-1（R4）3个浓度下的茶树根系总RNA,通过Illumina Hiseq Xten平台进行高通量转录组测序。结果表明,随着Al³⁺浓度的升高,根系POD（Peroxidase,过氧化物酶）活性逐渐下降,APX（Ascorbic acid peroxidase,抗坏血酸过氧化物酶）活性则逐渐升高。SOD（Superoxide dismutase,超氧化物歧化酶）活性在Al³⁺浓度为1βmmol·L^-1时最高,CAT（Catalase,过氧化氢酶）活性在各处理间无显著差异。根系中Al含量随着Al³⁺浓度的升高呈先上升后下降趋势,在Al³⁺浓度为1βmmol·L^-1时达到最高。经筛选得到R1 VS R0,R4 VS R0,R4 VS R1的DEGs（Differentially expressed genes）分别为1β894、2β439个和1β384个,显著上调（下调）的差异表达基因分别有733（1β161）、846（1β593）个和628（756）个。GO富集分析表明,3个处理组在生物学途径中富集最多的类别均为刺激响应。在分子功能和细胞组件方面,R1 VS R0和R4 VS R0富集最多的类别均为核酸结合转录因子活性和细胞外围,R4 VS R1富集最多的类别为氧化还原酶活性相关基因和膜区域。KEGG富集分析表明,R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分别显著富集了29、41条和19条Pathway,它们包括转录因子、转运蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成途径等,鉴定到多个参与调控活性氧代谢、有机酸或金属转运蛋白、转录因子及细胞壁结构修饰等生理过程的基因在Al诱导后上调或抑制表达,显示这些基因与茶树耐Al分子机制密切相关。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

茶树两个Dof转录因子的分离及其在温度胁迫中的响应分析

茶树是一种重要的经济作物,温度胁迫对茶叶生产影响较大。本研究以茶树品种迎霜为实验材料,克隆获得2个编码Dof转录因子的基因CsDof1和CsDof2。序列分析显示,CsDof1含有1 389 bp,编码463个氨基酸;CsDof2含有1 458 bp,编码486个氨基酸。CsDof1和CsDof2转录因子都具有典型的锌指结构域,分别位于第133~195和124~186个氨基酸位点之间。对CsDof1和CsDof2转录因子理化性质、亲/疏水性、二级和三级结构分析显示,两者都是亲水性蛋白且显偏碱性。空间结构分析显示,CsDof1和CsDof2均有1个α-螺旋,且Dof结构域的位点完全相同,均有4个半胱氨酸残基。实时定量PCR表明,CsDof1和CsDof2在不同茶树品种、不同温度胁迫下均能诱导表达,且表达呈现差异。     

浙江省主栽茶树品种工艺白茶的滋味成分研究

采摘浙农113、春雨1号、春雨2号、迎霜、鸠坑和安吉白茶6个浙江省主栽品种茶树鲜叶,按传统工艺加工白茶,跟踪测定加工过程中茶叶主要滋味成分的动态变化规律,以福鼎大毫茶品种为对照,对所得产品进行感官审评与理化分析。结果表明,萎凋过程中茶多酚与儿茶素含量降低,氨基酸含量升高。福鼎大毫茶的鲜度、苦度、涩度均为最强,安吉白茶甜度最强。浙农113、春雨1号、春雨2号感官审评综合品质最优,且喜好度最高。不同品种白茶间滋味成分含量差异显著,酯型儿茶素与白茶的苦度、涩度呈极显著正相关,与甜度呈显著负相关,鲜味氨基酸与鲜度呈显著正相关。综合感官审评与滋味品质成分,春雨1号与传统白茶风格最为接近,浙农113与春雨2号可以用于开发浙江白茶新产品。     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。     

光照敏感型新梢白化茶新品种‘御金香’春梢化学成分研究

用HLPC法检测了光照敏感型新梢白化茶品种‘御金香’春梢生物碱、儿茶素类、氨基酸类和光合色素类化合物含量,并以温度敏感型新梢白化茶品种‘白叶1号’和常规茶树品种‘福鼎大白茶’为对照。结果显示,‘御金香’咖啡碱和可可碱含量显著高于‘福鼎大白茶’和‘白叶1号’;儿茶素类总含量显著低于‘福鼎大白茶’和‘白叶1号。光照敏感新梢白化茶‘御金香’和温度敏感型新梢白化茶‘白叶1号’的氨基酸含量显著高于‘福鼎大白茶’,但叶绿素a和叶绿素b、β-胡萝卜素、黄体素和新黄质等光合色素含量显著低于‘福鼎大白茶’。‘御金香’呈现黄色叶片的白化现象主要是因为叶绿素含量低,而并非类胡萝卜素含量高所致。     

茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析

为研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系,本研究将‘龙井43’品种茶树花分为4个发育阶段,选择15个品种的茶树花为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析,同时测定Cu/Zn-SOD酶活性。结果表明:在茶树花的4个发育阶段中,第4阶段Cu/Zn-SOD酶活性最低,与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花Cu/Zn-SOD酶活性有较大差异,其中‘紫鹃’茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高,其次是‘黄金芽’和‘白叶1号’,‘黄观音’的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异,细胞质型Cu/Zn-SOD1基因表达水平远高于叶绿体型Cu/Zn-SOD2和过氧化物酶体Cu/Zn-SOD3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异,Cu/Zn-SOD1基因在‘黄牡丹’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号’和‘黄观音’茶树花中表达量最高,Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃’茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43’茶树花不同发育阶段Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显,而不同品种茶树花的Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了Cu/Zn-SOD酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间,为茶树花SOD进一步研究提供参考。     

遮光对光照敏感型新梢白化茶春梢化学成分含量的影响

以光照敏感型新梢白化茶树‘黄-2’、‘黄-8’和‘黄-13’为供试材料,在春季一芽一叶期采用30%透光度的黑色遮阳网覆盖遮光处理7天,HLPC法检测一芽二叶新梢咖啡因、儿茶素类、氨基酸类和色素类化合物含量。结果显示,遮光处理对茶叶咖啡因含量无显著影响;遮光对儿茶素类总含量的影响因品种而异,在品系‘黄-2’显著提高,而品系‘黄-8’和‘黄-13’则显著降低;遮光显著提高品系‘黄-13’的氨基酸总含量,降低品系‘黄-8’氨基酸总含量,但对品系‘黄-2’无显著影响;遮光显著提高β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b和新黄质的含量,显著降低紫黄质含量。具有热耗散作用的黄体素在光照敏感新梢白化茶品种的含量很低,是其容易受到强光胁迫伤害的原因。在强光照条件下,光照敏感型新梢白化茶叶片呈现黄色,主要是叶绿素含量显著降低,而不是因为胡萝卜素和叶黄素含量提高所致。根据这些研究结果,作者认为:在高温强光季节采取适度遮光,将有助于光照敏感型新梢白化茶提高叶片叶绿素含量,增强光合作用,进而提高茶苗生长势和抗性,有助于提高茶苗移栽成活率。     

烘干机温度PID控制系统及大红袍烘焙效果试验

阐述了新研制的烘干机温度PID控制系统结构原理。用该系统进行大红袍精制烘焙应用试验,研究表明,设定温度为180℃,PID控制系统平均热风温度为181.9℃,人工控制平均热风温度为188.9℃,PID控制烘焙温度比人工控制更加稳定,节煤率为22.97%~26.83%;PID控制与人工控制烘焙的两种等级大红袍茶多酚含量均达到显著水平,一级大红袍的氨基酸含量达到极显著水平,二级大红袍的氨基酸和可溶性糖含量达到显著水平;PID控制烘干的茶叶感官品质优于人工控制。     

套种圆叶决明改善茶园生态环境促进茶树生长

针对福建丘陵山地茶园普遍面临的土壤退化,季节性干旱严重、生态组分简单、生态环境恶化等生态问题,结合目前茶园管理模式,以常规清耕茶园(定期锄草)为对照,研究行间套种豆科绿肥闽引圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia ‘minyin’)对茶园温湿度、土壤理化性状、茶树生长等的影响。结果表明:与清耕茶园相比,套种圆叶决明显著提高茶园土壤有机质、速效氮、速效磷含量(P<0.05),其中土壤速效氮含量增加57.78 mg/kg;在夏季高温干旱时期,套种圆叶决明茶园土壤含水量(0~20 cm土层)显著提高(P<0.05),达21.84%,空气温度日变化幅度降低5.1℃,空气湿度日均值显著提高3.9%;同时显著提高夏茶氨基酸及茶水浸出物含量(P<0.05)。茶园套种圆叶决明能有效改善茶园土壤质量及光、温、湿等小气候条件,表明该品种是一种适宜山地茶园推广利用的优良绿肥。