天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.     

大豆铁结合蛋白基因的克隆及其推定蛋白结构分析

根据GeneBank数据库中大豆类铁结合蛋白序列设计引物,通过反转录方法从豫豆8号中克隆到cDNA片段,测序结果表明,该基因cDNA全长752 bp,编码250氨基酸.利用DNAMAN软件进行序列比对分析发现,该cDNA的氨基酸序列与大豆(M64337.1)铁结合蛋白同源性高达98%以上.运用生物信息学软件及相关网站对其功能位点、结构功能域分析,结果显示,该基因具有1个FER-RITIN-LIKE功能域、2个铁结合蛋白基因家族铁结合区域的信号序列、6个磷酸化位点等重要功能位点.     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

草鱼抗病毒基因Mx全长cDNA的克隆、序列分析与真核表达载体构建

Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域和一个发动蛋白家族的典型结构特征序列。生物信息学分析表明,草鱼Mx基因所编码的蛋白质以亲水区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,但无明显的核定位序列,空间结构包括N端的GTP酶结构域(GTPase domain)、中间的中央相互作用结构域(central interactive domain,CID)和C端的GTP酶效应结构域(GTPase effector domain,GED)。同源性分析显示,草鱼Mx蛋白氨基酸序列和其他物种的相似性为45.1%～99.7%。此外还成功构建了含草鱼Mx基因cDNA全序列的真核表达载体pEGFP-C1-Mx。研究亮点:首次通过干扰素诱生剂PolyI∶C诱导草鱼肾细胞的方法克隆得到了草鱼抗病毒基因Mx cDNA全序列,并且借助生物信息学软件对其编码的氨基酸进行了序列分析,还成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-Mx,为进一步研究草鱼Mx蛋白的生物学活性及其在抗鱼类病毒性疾病中的应用奠定基础。     

牛DAZL基因序列分析、克隆及表达载体构建

利用生物信息学方法对牛DAZL基因的一级结构和同源性进行分析,并根据牛DAZL基因序列设计引物来克隆该基因,通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体,成功克隆到了DAZL基因。生物信息学分析结果显示,哺乳动物的DAZL基因同源性很高。此外,构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒p EGFP-N3-DAZL。     

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85 kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的hLYZ cDNA序列的同源性为99%。推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

平邑甜茶新根扩展蛋白基因MhEXP1的cDNA全序列克隆及表达

【目的】对平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp）Rehd. var pinyiensis Jiang]新根扩展蛋白基因进行克隆和表达分析,为揭示扩展蛋白在平邑甜茶根系生长发育中的功能打下基础。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术克隆扩展蛋白同源基因,并通过Northern杂交研究其在不同器官中的表达情况及吲哚丁酸（IBA）的处理效应。【结果】成功地从平邑甜茶白色新根中获得了一个全长的扩展蛋白基因,命名为MhEXP1,GenBank登录号为DQ538346。MhEXP1 cDNA全长1 111 bp,含有771 bp的完整开放阅读框,编码257个氨基酸,预测分子量和等电点分别为27.8kD和8.9。序列分析表明,MhEXP1具有扩展蛋白的典型结构,即氨基酸序列N端有８个半胱氨酸残基,1个组氨酸（His-Phe-Asp,HFD）域,C末端存在4个保守的色氨酸残基。Northern杂交表明,该基因在平邑甜茶叶片中表达量很低,但在新根中大量表达并受IBA诱导,且随着IBA处理时间的延长表达量逐渐增加。【结论】成功地从平邑甜茶中克隆了一个全长的扩展蛋白基因MhEXP1,该基因在叶片中表达量很低但在新根中大量表达,并受IBA诱导;MhEXP1参与IBA调节的平邑甜茶根系生长发育。     

中国环颈雉心脏型脂肪酸结合蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

运用RT-PCR技术,克隆了中国环颈雉心脏型脂肪酸结合蛋白基因的序列,并对其进行了测序及生物信息学分析。结果表明:中国环颈雉H-FABP基因cDNA序列长为402bp,开放阅读框为399bp,编码132个氨基酸,推测的蛋白相对分子质量为14.64KD,等电点为6.30。中国环颈雉H-FABP基因与已报道的鸡、鸭、珍珠鸡等禽类动物的核苷酸和编码氨基酸序列具有很高的相似性。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

猪BYSL基因克隆、序列特征及表达分析

BYSL基因是哺乳动物胚胎着床和胚胎发育的关键因子。为进一步研究猪BYSL基因的结构与功能,揭示其表达模式,本研究结合基因同源序列克隆技术和RT-PCR方法克隆了猪BySL基因;利用生物信息学软件对该基因进行序列特征和结构分析;利用Real-time PCR技术分析了BYSL基因的时空表达模式。结果表明,猪的BYSL编...     

激发子隐地蛋白(cryptogein)基因的克隆及其植物表达载体的构建

从隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)中克隆cryptogein蛋白激发子基因,经测序证实后.针对病原菌侵染和cryptogein基因本身的特点,选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型、并受病原菌诱导的水稻苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的启动子;同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外,更好地与植物细胞膜受体互作,在cryptogein基因前还融合了烟草病程相关蛋白PR1b的信号肽.然后将此融合基因克隆到植物表达载体CHF3中,获得植物双元表达载体CHF3-PAL-PR1b-Cry,再将此载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中.     

人胰岛素A、B链基因表达载体的构建与大豆遗传转化

使用大豆偏爱密码子,人工合成人胰岛素A、B链基因IN。将合成的人胰岛素A、B链基因IN与携带有CaMV35S启动子的质粒pBI121重组,构建成IN植物表达载体pBI121-IN。再以大豆品种吉30子叶节为外植体,以根癌农杆菌EHA105介导进行遗传转化,在筛选培养基上直接诱导分化,获得了Km大豆抗性苗。     

大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA克隆及其真核表达载体的构建

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法克隆大鳞副泥鳅生长激素基因(pGH)cDNA。结果表明,克隆到的pGH的开放阅读框包括633 bp,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,GenBank注册号为DQ350432。把pGH成熟肽的cDNA插入真核表达载体pPIC3.5K,PCR技术、酶切和测序证明重组子中确实定向插入了pGH成熟肽片段;将重组的pPIC3.5K-pGH用SalⅠ酶切后,转化巴斯德毕赤酵母GS115,PCR技术筛选证明pGH已经整合到酵母染色体上。从而成功克隆大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA,并构建了胞内真核表达载体pPIC3.5K-pGH。     

OsWRKY79基因克隆和植物表达载体的构建

WRKY是植物体中重要的转录因子,克隆水稻Os WRKY79基因将为其在植物体内的定位和功能研究奠定基础.根据GenBank公布的Os WRK Y79基因序列设计特异引物,以RT-PCR法从水稻幼苗中克隆OsWRKY79基因,将其亚克隆至含有GFP基冈的pBinGFP表达载体中,经菌落PCR和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pBinGFP-Os WRKY79.     

雪花莲凝集素基因(GNA)植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

将雪花莲凝集素基因(GNA)取代GUS基因正向插入到Ti质粒载体pBI121的35S启动子之下,构建成植物表达载体pBI121/GNA,并将其导入农杆菌LBA4404中.通过该农杆菌介导转化烟草红花大金元,得到卡那霉素抗性植株159株,PCR检测表明其中102株为阳性.对8株PCR阳性植株进行了抗蚜虫生物活性检测,抑制蚜虫密度为25%～90%.     

大豆GmPR10基因克隆与植物表达载体的构建

为探明大豆中PR10蛋白质基因的抗大豆花叶病毒(SMV)作用机理,从抗SMV材料中克隆到GmPR10基因完整的cDNA序列,GmPR10基因的开放阅读框(ORF)全长477 bp,编码158个氨基酸。序列比对与进化树分析结果表明：GmPR10是大豆中一个新的PR10蛋白质基因,GmPR10基因在大豆的根、茎、叶中均能表达,接种大豆SMV后该基因在大豆叶片中被强烈诱导并高效表达,推测其可能使植物本身获得系统抗性以抵抗外来病原菌的侵袭。该研究构建了GmPR10基因的植物表达载体,为探究GmPR10基因在大豆抗病中的分子作用机理打下了基础。     

诱导型启动子Rd29A引导的植物表达载体的构建

全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁,抗盐育种具有重要意义.针对常规育种周期长等明显的局限性,利用抗盐转基因可以迅速获得抗盐材料,明显缩短育种周期.利用PCR技术克隆获得Rd29A这一干旱、盐碱等逆境诱导表达的特异性启动子,与叶绿体转运肽和甜菜碱醛脱氢酶基因构建pBinRdMCS重组质粒,用于林木转化.通过克隆Rd29A启动子构建逆境诱导的高效表达载体,可对林木抗盐转基因育种提供理论指导. 图5参8     

Cloning of strawberry FaEtr2 gene and its plant expression vector construction for antisense RNA

An ethylene receptor FaEtr2 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from ripening strawberry fruit. A 1049-bp PCR product (All Star-Etr2) was cloned. Sequence analysis showed that the All Star-Etr2 nucleotide sequence had 100% identity with Chandler-Etr2 from the GenBank. A pair of primers containing restriction enzyme sites were designed and used to amplify the sequenced plasmid. The PCR product was digested by the corresponding restricted enzymes and inserted between the CaMV 35S promoter and NOS terminator of expression vector pBI121 directionally. The constructed expression vector was transformed into Agrobacterium fumefeciens LBA4404 in the follow-up research to silence a ripening-related ethylene receptor FaEtr2 gene in strawberry fruits.